用于磁性靶向治療肺纖維化的聚多巴胺包覆的Fe3O4/甲強龍/環(huán)磷酰胺復合超粒子

孫啟睿，趙 楠，劉樹威，辛 華，張 皓，張樂寧

（1.吉林大學化學學院,長春130012；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科,長春130033）

2020年以來，新冠病毒在全球瘋狂肆虐，現(xiàn)已造成近2.0億人感染，逾400萬人死亡.除造成大量患者死亡外，肺纖維化作為重癥新冠肺炎的后遺癥之一，持續(xù)威脅患者生命.肺纖維化是一種進行性、致命性的間質性肺部疾病，其主要病理特征是成纖維細胞過度增殖、活化，細胞外基質沉積增多，并伴有炎癥損傷和組織結構破壞，最終導致患者肺功能喪失和呼吸衰竭死亡［1］.肺纖維化患者的平均生存期僅為3~5年，死亡率高于大多數腫瘤.目前，肺纖維化的治療方法主要包括臨床常規(guī)療法、細胞因子及其抑制劑療法、抗氧化藥物、基因療法和肺移植等［2］.其中，常規(guī)療法是使用甲強龍（MPS）等糖皮質激素和環(huán)磷酰胺（CTX）等免疫抑制劑進行聯(lián)合治療［3，4］，由于具有價格優(yōu)勢而易被廣大患者接受.雖然糖皮質激素和免疫抑制劑聯(lián)合療法對肺纖維化有較好的療效，但該方法存在明顯的不良反應［5］.需要發(fā)展新的藥物遞送方法降低血液中藥物分子的濃度，同時提高藥物分子在病灶部位的富集量.

可穿戴磁性靶向技術是近年來發(fā)展起來的一種體外輔助控制藥物遞送方法，主要原理是在外加磁場作用下引導磁性納米載體藥物在目標部位的富集，具有簡便、無損傷、增加藥物滯留率及降低對正常組織毒副作用等優(yōu)點［6］.作為磁性靶向技術的核心，磁性納米載體藥物的設計尤為重要，需要根據藥物分子的特性和治療機理，選擇適當的磁性納米載體，建立合理的復合方法［7］.Fe3O4納米材料是一種經過美國食品藥品監(jiān)督管理局認證的生物安全的超順磁性材料，具有低毒、低成本及高順磁性等特點［8］.從納米載體藥物制備角度來看，納米尺寸的Fe3O4粒子便于和藥物分子進行組合、裝配及修飾，是設計納米載體的首選［9］.但Fe3O4納米粒子（Fe3O4NPs）的磁性與其尺寸大小密切相關，粒子的尺寸越大磁性越強［10］.因此，從提高磁靶向性能來看，制備納米載體時，還需要將尺寸較小的Fe3O4NPs按照一定的方式在載體內部進行組裝，獲得Fe3O4超粒子（Fe3O4SPs）［11］.此外，為了提高納米載體的生物相容性，通常需要在載體表面修飾生物相容的高分子材料.其中，聚多巴胺（PDA）是一種具有優(yōu)良表面吸附性、生物相容性和可降解性的高分子材料，可以在室溫、堿性條件下由多巴胺單體聚合獲得［12］.由于性能優(yōu)異，PDA已經被廣泛用于各種金屬、金屬氧化物及半導體納米粒子等的表面修飾［13］，極大地促進了各種納米粒子及納米載體的診療應用.

基于磁性靶向治療肺纖維化的思路，本文設計了一種聚多巴胺包覆的Fe3O4納米粒子/甲強龍/環(huán)磷酰胺復合超粒子（Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs），研究了其制備方法、穩(wěn)定性、磁性、藥物負載及釋放，分析了其生物毒性，并建立動物模型驗證了其磁性靶向功能.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙酰丙酮鐵（純度≥99.9%）、1，2-十六烷醇（純度90%）、十八烯（ODE，純度90%）、油酸（OA，純度90%）、油胺（OLA，純度70%）和鹽酸多巴胺（DA，99%）購自美國Sigma-Aldrich公司；甲苯（分析純）購自北京化工廠；無水乙醇（分析純）和正己烷（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司（京試）；十二烷基硫酸鈉（SDS，化學純）購自國藥集團化學試劑有限公司（滬試）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥99.9%）和環(huán)磷酰胺（CTX，純度97%）購自阿拉丁試劑有限公司；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/支）由美國輝瑞公司生產；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，粉劑）購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；細胞實驗培養(yǎng)基采用索萊寶DMEM高糖培養(yǎng)基；血清采用Gemini胎牛血清（FBS）；動物實驗采用遼寧長生生物技術股份有限公司KM小鼠（雄性，28 d齡）；所有試劑均直接使用，未做進一步純化處理.實驗過程中配制樣品與洗滌樣品均使用無水乙醇和去離子水.

H-800型透射電子顯微鏡（TEM），日本Hitachi公司；Agilent technologies G7114A型高效液相色譜儀（HPLC），色譜條件：色譜柱采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈/水/3%冰醋酸水溶液（體積比為35/60/5）的混合物，檢測速度1.0 mL/min，檢測波長195 nm，254 nm，柱溫20℃，進樣量20 μL；UV-2600型紫外-可見吸收光譜儀（UV-Vis），日本島津公司；ZETA SIZER Nano-ZS型動態(tài)光散射納米粒度儀（DLS），英國Malvern公司；VERTEX 80V型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），德國布魯克公司；SQUID-MPMS-XL型磁性測量系統(tǒng)［磁場測試范圍-30~30 kOe（1 kOe=80 kA/m），測試溫度300 K］；Q500型熱重分析儀（TGA），美國TA儀器公司；ICP-5000型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-OES），杭州聚光科技股份有限公司.

1.2 Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs復合超粒子的制備

首先通過熱分解法制備OA修飾的Fe3O4NPs［14］.將0.7064 g乙酰丙酮鐵、1.2922 g 1，2-十六烷醇、10 mL ODE、1.91 mL OA和1.975 mL OLA依次加入圓底三頸燒瓶中，抽真空后于氮氣保護下攪拌15 min后再升溫至200℃并反應30 min，然后以3℃/min的速率升溫至265℃并反應30 min；待反應溶液冷卻至室溫后加入40 mL無水乙醇洗滌，離心后的固體產物使用甲苯分散，得到OA修飾的Fe3O4NPs.

進一步通過水包油的微乳液模板法制備Fe3O4SPs［15］.將12.5 mL SDS水溶液（4 mg/mL）和4 mL Fe3O4NPs甲苯溶液（7 mg/mL）加入到三頸燒瓶中，置于超聲攪拌水浴加熱裝置中，室溫超聲攪拌10 min使甲苯溶液在水中均勻分散，再于56℃加熱至甲苯完全揮發(fā)，得到Fe3O4SPs水溶液.

在室溫條件下，將10 mL Fe3O4SPs水溶液、2 mL DA水溶液（5.6 mg/mL）、10 mg CTX、10 mg甲潑尼龍琥珀酸鈉依次加入40 mL Tris（10 mmol/L，pH=8.5）水溶液中，置于搖床上于室溫下振蕩4.5 h后離心，即得到Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs復合超粒子.

1.3 細胞毒性實驗

在37℃、5%CO2條件下將人腸系膜下腔動脈血管內皮細胞（Ealy926細胞）以5000 cell/孔的密度接種在96孔板中，24 h后將Ealy926細胞與濃度分別為0，25，50，100，150，200 μg/mL的Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs共培養(yǎng)；24 h后向每孔中加入10 μL CCK-8，繼續(xù)孵育2 h后使用酶標儀測試450 nm處的光密度值，計算細胞的相對存活率.按照相同的實驗方法考察Fe3O4@PDA SPs的細胞毒性.

1.4 動物磁性靶向實驗

本文所涉及動物實驗方案通過了吉林大學動物實驗倫理審查.KM小鼠體內磁性靶向實驗分為對照組和實驗組兩組，每組包含5只小鼠.在兩組實驗中，小鼠的給藥方式和劑量相同，均為經尾靜脈注射60 μL含有300 μg Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的生理鹽水.對照組不穿戴磁性靶向設備，實驗組穿戴磁性靶向設備；24 h后，對兩組小鼠進行安樂死，解剖獲取小鼠肺臟，熱消解后，用去離子水稀釋；使用ICP-OES測試溶液中鐵離子含量，用于反映Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs在肺部的富集程度，驗證磁性靶向效果.

2 結果與討論

2.1 Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的制備

制備Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs需要預先合成Fe3O4SPs.圖1（A）給出用于合成Fe3O4SPs的Fe3O4NPs的TEM照片和平均尺寸.從圖1（A）可以看出，F(xiàn)e3O4NPs為近球形粒子，尺寸分布較均一，平均直Fig.1 TEM images of Fe3O4NPs(A)and Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs(B)and DLS size distribution of Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs(C) Insets of(A)and(B):the corresponding TEM size distribution.

徑為5.1 nm.Fe3O4NPs表面修飾了OA，因此可分散在甲苯等疏水溶劑中［14］.利用Fe3O4NPs疏水的特點，通過構筑水包油微乳液模板法合成了Fe3O4SPs.該方法將Fe3O4NPs甲苯溶液與水混合，并以SDS為穩(wěn)定劑，經攪拌形成分散在水中的甲苯液滴，F(xiàn)e3O4NPs存在于甲苯相中.在持續(xù)攪拌下，于56℃蒸發(fā)體系中的甲苯后，得到SDS包覆的Fe3O4SPs.由于SDS包覆的Fe3O4SPs表面帶負電，帶正電的多巴胺單體能夠吸附在Fe3O4SPs表面，并進一步在室溫堿性條件下發(fā)生聚合，得到Fe3O4@PDA SPs［16］.在形成PDA殼層時引入甲潑尼龍琥珀酸鈉和CTX，得到Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs.圖1（B）為Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的TEM照片，可以看到Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的核由小粒子堆積而成，核的表面有平均厚度為6.8 nm的低襯度殼層，整體SPs的 平 均 直 徑 為79.5 nm.圖1（C）為Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的DLS圖，其平均尺寸為86.7 nm，略大于TEM觀測到的尺寸，這是因為DLS測得的是SPs在溶液中的水合直徑，而TEM觀察到的是干態(tài)條件下SPs的尺寸.需要說明的是，本文使用水溶性更佳的甲潑尼龍琥珀酸鈉作為MPS的前藥，甲潑尼龍琥珀酸鈉遇水脫除琥珀酸鈉轉化為MPS，并以MPS的形式存在于Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs中.

圖2 給出各樣品的FTIR光譜圖.Fe3O4/MPS@PDA SPs和Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs Fig.2 FTIR spectra of MPS,CTX,Fe3O4@PDA SPs,Fe3O4/MPS@PDA SPs,Fe3O4/CTX@PDA SPs and Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的譜 線在1655和1577 cm?1處出現(xiàn)MPS的特征峰，證明SPs中存在MPS.Fe3O4/CTX@PDA SPs和Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的譜線在1130，977，950和894 cm?1處出現(xiàn)了CTX的特征峰，證明SPs中存在CTX.

2.2 磁富集性能

圖3 （A）為300 K條件下，設定循環(huán)磁場強度為-30~30 kOe，通過磁性測量系統(tǒng)得到的Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的M-H曲線.結果表明，該SPs展現(xiàn)出強的磁性能，其飽和磁化強度為42 A·m2/kg.M-H曲線沒有表現(xiàn)出剩磁或矯頑力，說明Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs具有超順磁性.Zhang等［17］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4SPs及Fe3O4@PDA SPs均為超順磁性材料，表明MPS和CTX的引入沒有改變SPs的超順磁特點.圖3（B）示出了Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs在外加磁場引導下的富集行為，經磁鐵吸引10 s后，該SPs全部被富集到磁鐵周圍.由于Fe3O4NPs組裝成了尺寸更大的SPs，集成效應使其具有較強的磁性［10］.該磁場引導下的富集過程是可逆的，撤去磁場并輕微晃動后，SPs即可重新分散到溶液中.Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs在磁場引導下的富集行為為進一步設計可穿戴磁裝置、實現(xiàn)磁性靶向治療肺纖維化提供了可能.

Fig.3 M?H curve of Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs(A)and photograph of the solution of Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs without and with a magnet(B)

2.3 穩(wěn)定性、藥物負載及釋放

Fig.4 Temporal evolution of the UV?Vis absorption spectra(A—C)and the corresponding solution photographs(D—F)of Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs at pH of 8.0(A,D),7.4(B,E),and 6.0(C,F)

Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs具有較好的穩(wěn)定性.由圖4（A）可見，在pH=8.0的水溶液中放置3 d后，其吸收光譜基本未發(fā)生變化.圖4（D）為對應溶液的照片，溶液的狀態(tài)和顏色均無改變.進一步考察了Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs在生理鹽水、PBS、細胞培養(yǎng)基及含10%血清的細胞培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性.由圖5可見，放置3 d后，SPs會從生理鹽水和PBS溶液中沉淀，這是因為Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs靠靜電排斥力分散在水中，高的鹽濃度會減小Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs之間的斥力，引起其緩慢聚集.該沉淀經振蕩后可重新分散，說明聚集是可逆的，沒有破壞Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的結構.該SPs在細胞培養(yǎng)液及血清中穩(wěn)定性良好，放置3 d后溶液沒有發(fā)生明顯變化.較好的穩(wěn)定性主要歸結為PDA殼層的保護作用［18］.

Fig.5 Photographs of Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs in saline,PBS,cell culture medium and cell culture medium with 10%FBs

肺部環(huán)境的pH值與人體體液的pH值范圍相同，為7.35~7.45.因此，本文考察了Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs在近中性和弱酸性條件下的穩(wěn)定性.圖4（B）和（C）分別為pH值為7.4和6.0時Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs隨時間變化的吸收光譜.在pH=7.4條件下放置1 d后，F(xiàn)e3O4/MPS/CTX@PDA SPs的吸收光譜強度產生下降，3 d后強度下降更顯著，說明其發(fā)生了拆解.吸收光譜在pH=6.0條件下的變化比pH=7.4時更明顯，說明酸性環(huán)境有利于Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs拆解.從圖4（E）和（F）對應的溶液照片同樣觀察到明顯的顏色變淺，表明Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs在酸性條件下發(fā)生了拆解.Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs在弱堿性條件下穩(wěn)定、在近中性和弱酸性條件下易拆解的特點有利于MPS和CTX在肺部的釋放.

通過HPLC研究了Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs中MPS和CTX的負載率、包封率及釋放情況（圖6）.由圖6（A）可見，在HPLC結果中MPS對應的保留時間為10.30 min，CTX對應的保留時間為3.03 min.圖6（B）為MPS濃度對應HPLC峰面積的標準曲線，圖6（C）為CTX濃度對應HPLC峰面積的標準曲線.它們的標準曲線均呈線性，可以根據樣品實測的HPLC峰面積得到對應的藥物濃度.其中，藥物負載率=（SPs中藥物質量）÷（SPs質量）×100%；藥物包封率=［1?（溶液中殘留藥物質量÷藥物總質量）］×100%.結合HPLC結果計算可知，F(xiàn)e3O4/MPS/CTX@PDA SPs中MPS和CTX的負載率分別為8.7%和6.3%，包封率分別為9.6%和6.8%.藥物的負載率和包封率均不高，這主要是由Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs的結構決定的.該SPs由內部疏水的Fe3O4SPs核和較親水的PDA殼層組成.MPS和CTX均為親水藥物，無法進入Fe3O4SPs核，只能存在于PDA殼中.而PDA殼層厚度只有6.8 nm，無法負載更多的藥物.我們曾嘗試在Fe3O4SPs核中負載MPS和CTX，但沒有成功，也驗證了上述推測.此外，通過TGA表征可知，F(xiàn)e3O4/MPS/CTX@PDA SPs中的有機物組分要小于40%，說明PDA殼層中30%以上的有機組分為負載的MPS和CTX.這一負載率并不低.

模擬肺部pH=7.4和37℃環(huán)境，考察了藥物分子的釋放動力學.由圖6（D）可見，CTX的釋放速率比MPS快.隨時間的延長，CTX和MPS兩種藥物的釋放率均逐漸增加.10 h后，CTX的釋放率為44.7%，MPS的釋放率為29.7%，符合對藥物釋放的基本要求.

Fig.6 HPLC characterization of Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs

2.4 細胞毒性及動物磁性靶向性

通過比較Fe3O4@PDA SPs和Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs對Ealy926細胞存活率的影響考察了細胞毒性（圖7）.由圖7（A）可見，F(xiàn)e3O4@PDA SPs的毒性較低，濃度為200 μg/mL時細胞存活率仍達到89%.較低的毒性得益于生物相容的PDA的包覆有效避免了Fe3O4@PDA SPs核中有毒物質的釋放［19］.輕微的毒性主要來自制備Fe3O4@PDA SPs時引入的SDS［20］.由圖7（B）可見，F(xiàn)e3O4/MPS/CTX@PDA SPs的毒性也較低，濃度達到200 μg/mL時細胞存活率仍維持在85%以上.

Fig.7 Cell viability of Ealy926 cells treated with Fe3O4@PDA SPs(A)and Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs(B)

圖8 （A）和（B）為Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs用于可穿戴磁性靶向設備富集實驗的照片，在設備與小鼠肺部對應的位置加入了起磁性靶向作用的磁鐵.分別對未穿戴設備組和穿戴設備組的小鼠進行尾靜脈注射Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs，24 h后取肺臟進行Fe元素測定，并根據Fe元素計算SPs的肺部滯留率.發(fā)現(xiàn)穿戴設備組的肺部滯留率為9.81%ID/g（ID：inject dose），而未穿戴設備組的滯留率為8.93%ID/g［圖8（C）］，證明Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs具有良好的磁性靶向肺部富集作用，對于磁性靶向治療肺纖維化具有潛在應用價值.

Fig.8 Photographs of a mouse without(A)or with(B)magnetic dress to achieve magnetic targeting of Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs towards lungs and comparison of the retention of SPs in lungs without or with magnetic dress(C)

3 結 論

從調控油溶性Fe3O4NPs自組裝出發(fā)，首先借助水包油微乳液模板法制備了Fe3O4SPs，并在包覆PDA殼層的過程中同時引入治療肺纖維化的藥物MPS和CTX，得到Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs.作為核的Fe3O4SPs賦予材料優(yōu)異的超順磁性，可以在外加磁場引導下發(fā)生富集.PDA殼層的引入一方面提高了材料的生物相容性，另一方面有利于負載MPS和CTX.Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs在模擬肺部pH值條件下可以釋放出MPS和CTX.體外細胞實驗表明Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs具有較低的生物毒性.可穿戴磁性靶向動物實驗證明Fe3O4/MPS/CTX@PDA SPs具有良好的磁性靶向肺部富集功能.本文提出了一種磁性靶向治療肺纖維化的策略，為解決目前臨床常規(guī)的MPS聯(lián)合CTX治療方案的毒副作用問題提供了新思路.