丁苯酞減輕H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈和臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷

楊曉麗，王 征，張艷茹，冀靜靜，王孟帥

(1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 邯鄲 056001;4.邯鄲市第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河北 邯鄲 056001 )

內(nèi)皮功能障礙在動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[1-2]，其發(fā)生機(jī)制包括氧化應(yīng)激[3]。動(dòng)脈粥樣硬化與卒中、心肌梗死及腎臟病變等多種疾病密切相關(guān)。因此研究如何保護(hù)內(nèi)皮功能至關(guān)重要。在研究?jī)?nèi)皮功能時(shí)一般選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)，人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAECs)主要用于動(dòng)脈粥樣硬化的體外研究，但因HUAECs的培養(yǎng)難度較大，以往研究選用的較少。因內(nèi)皮功能與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，因此同時(shí)選用兩種內(nèi)皮細(xì)胞研究?jī)?nèi)皮功能可使得到的結(jié)果更加可靠。

丁苯酞主要用于治療急性缺血性卒中[4]，也可抑制神經(jīng)元凋亡[5]。但丁苯酞是否具有內(nèi)皮保護(hù)作用目前研究較少。本實(shí)驗(yàn)主要研究氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VECs)造成的影響以及丁苯酞是否具有內(nèi)皮保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為保護(hù)內(nèi)皮功能尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(上海吉?jiǎng)P基因細(xì)胞庫(kù))，人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUAECs)(北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清(Gibco公司)；H2O2(河北健寧藥業(yè)有限公司)；丁苯酞(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè))；MTT(Biosharp公司)；羅丹明123和Annexin V/PI凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Fura-4/AM(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：將HUVECs和HUAECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素-鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

首先建立H2O2損傷模型和檢測(cè)NBP對(duì)細(xì)胞的影響。將細(xì)胞分為對(duì)照組，不同劑量H2O2干預(yù)組及NBP組(劑量：5和10 μmol/L)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果H2O2劑量在50～200 μmol/L時(shí)對(duì)HUVECs沒(méi)有明顯損傷作用，但對(duì)HUAECs已顯現(xiàn)出損傷作用，因此選用300、500、700和900 μmol/L的H2O2劑量與HUVECs共培養(yǎng)24 h，選用100、200、300和400 μmol/L的H2O2劑量與HUAECs共培養(yǎng)24 h，來(lái)選取IC50值。

建立H2O2損傷模型后，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為對(duì)照組，不同劑量H2O2干預(yù)組(HUVECs組H2O2劑量：700 μmol/L；HUAECs組H2O2劑量：300 μmol/L)及NBP處理組(劑量：5和10 μmol/L，在H2O2前2 h加入)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：兩種細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，小心吸掉舊培養(yǎng)基后每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床上搖10 min，溶解生成的藍(lán)紫色結(jié)晶，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度值。

1.2.3 羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位：將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，按照試劑操作說(shuō)明配制細(xì)胞后加入10 μmol/L羅丹明123，在37 ℃的環(huán)境中，30 min后應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，然后立即進(jìn)行流式分析，結(jié)果用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行處理。

1.2.4 Annexin V/PI檢測(cè)凋亡細(xì)胞：將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，按照試劑操作說(shuō)明配制細(xì)胞后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，保持在黑暗環(huán)境中15 min，濾過(guò)后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，結(jié)果用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行處理。

1.2.5 Fura-4/AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣：將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，按照試劑操作說(shuō)明配制細(xì)胞后加入5 mmol/L Fluo-4/AM，40 min后用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化，結(jié)果用Expo 32 ADC軟件進(jìn)行處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 丁苯酞對(duì)兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞均無(wú)毒性作用

兩種劑量的丁苯酞(5和10 μmol/L)對(duì)兩種細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比無(wú)差異(圖1)。

圖1 兩種劑量的丁苯酞對(duì)HUVECs(A)和HUAECs(B)均無(wú)明顯影響Fig 1 NBP had no effect on the cell viability of HUVECs (A)and HUAECs n=5)

2.2 H2O2刺激可導(dǎo)致兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活力下降

隨著H2O2劑量逐漸升高，HUVECs(圖2A)和HUAECs(圖2B)的細(xì)胞活力逐漸下降。與對(duì)照組相比，H2O2劑量分別為700和300 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力下降約50%(P<0.05)，因此選取700和300 μmol/L的H2O2劑量來(lái)建立HUVECs和HUAECs的氧化損傷模型。

*P<0.05 compared with control group圖2 不同劑量的H2O2均可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活力下降Fig 2 Cell viability of HUVECs (A)and HUAECs (B)were assessed after various dosages of H2O2 treatment, the injury of the cells induced by H2O2 was in a dosage-dependent manner n=5)

2.3 丁苯酞可改善H2O2導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力下降

兩種劑量的丁苯酞(5和10 μmol/L)提前干預(yù)HUVECs(圖3A)和HUAECs (圖3B)2 h后，再分別與700和 300 μmol/L的H2O2共培養(yǎng)24 h。與H2O2組相比，提前加入任何一種劑量的丁苯酞細(xì)胞活力都明顯升高(P<0.05)，并且丁苯酞?jiǎng)┝繛?0 μmol/L時(shí)效果更明顯。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group圖3 丁苯酞可改善H2O2導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，高劑量的丁苯酞效果更明顯Fig 3 NBP improved the decrease of cell viability in VECs induced by H2O2,and high dosage of NBP had better effect n=5)

2.4 丁苯酞可減輕H2O2介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位下降

由于高劑量的丁苯酞作用較明顯，因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，選用丁苯酞的劑量為10 μmol/L。與對(duì)照組相比，H2O2刺激可導(dǎo)致兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體膜電位下降(P<0.05)，然而提前加入丁苯酞可使細(xì)胞線粒體膜電位下降的程度明顯減輕(P<0.05)(圖4)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group圖4 丁苯酞可減輕 H2O2介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位下降Fig 4 NBP reduced the decrease of mitochondrial membrane potential mediated by H2O2 in VECs n=3)

2.5 丁苯酞可抑制 H2O2介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比，H2O2刺激兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞均可引起明顯的細(xì)胞凋亡(P<0.05)，而提前加入丁苯酞可明顯抑制H2O2引起的細(xì)胞凋亡(P<0.05)(圖5)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group圖5 丁苯酞可抑制 H2O2導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡Fig 5 NBP inhibited the apoptosis of VECs induced by H2O2 n=3)

2.6 丁苯酞可減少H2O2介導(dǎo)的兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣超載

與對(duì)照組相比，H2O2刺激可引起兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離鈣增多(P<0.05)，而提前加入丁苯酞可明顯減少兩種細(xì)胞內(nèi)游離鈣的生成，防止鈣超載(P<0.05)(圖6)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group圖6 丁苯酞可減少 H2O2導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣超載Fig 6 NBP reduced H2O2-induced calcium overload in VECs n=3)

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞是血管腔表面的單層細(xì)胞，起著物理屏障的作用，可合成和釋放多種血管活性物質(zhì)，在血管自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起著重要作用。內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的早期標(biāo)志，因此保護(hù)內(nèi)皮功能是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟。活性氧(ROS)包括過(guò)氧化氫(H2O2)和羥自由基(OH-)等，在許多生理和病理生理事件中起著重要作用。過(guò)量的ROS是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的主要原因[6-7]。過(guò)量的ROS可誘導(dǎo)線粒體雙層膜通透孔開(kāi)放，釋放Ca2+和細(xì)胞色素C，進(jìn)而引起促凋亡蛋白釋放，最后使線粒體外膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2對(duì)兩種血管內(nèi)皮細(xì)(HUVECs和HUAECs)均可導(dǎo)致明顯損傷，細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞凋亡增加。

大量的研究報(bào)道了丁苯酞在改善急性缺血缺氧損傷方面的神經(jīng)保護(hù)作用[9-10]，但丁苯酞是否具有內(nèi)皮保護(hù)作用并不十分清楚。本研究證實(shí)了兩種劑量的丁苯酞對(duì)H2O2誘導(dǎo)的兩種血管內(nèi)皮損傷均具有保護(hù)作用，高劑量的效果較明顯，這與既往的研究結(jié)果相同[11]。丁苯酞可減輕H2O2對(duì)兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞所造成的氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡，表明丁苯酞可通過(guò)抗氧化作用保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

線粒體膜電位損傷是線粒體功能受損的標(biāo)志，細(xì)胞內(nèi)鈣超載不僅可影響血管活性物質(zhì)正常作用的發(fā)揮，還可以導(dǎo)致線粒體吸收鈣增多，導(dǎo)致線粒體功能障礙[12]。丁苯酞可抑制H2O2介導(dǎo)的兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體膜電位下降及細(xì)胞內(nèi)鈣超載，表明丁苯酞可通過(guò)保護(hù)線粒體這一途徑來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述，本研究證實(shí)了丁苯酞可減輕氧化應(yīng)激介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。丁苯酞可通過(guò)提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，改善線粒體功能等途徑保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，從而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。本研究選用兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞，使得到的結(jié)果更加全面和可靠，為臨床應(yīng)用保護(hù)內(nèi)皮功能藥物和抗動(dòng)脈粥樣硬化治療開(kāi)辟了新的選擇方法。