CRISPR/Cas9技術(shù)在組蛋白去甲基化酶Kdm2b基因大片段敲除小鼠模型構(gòu)建中的應(yīng)用

陳素珠，笪琳萃，黃志清，巍巍，黃鵬宇，鄭備紅

福建省婦幼保健院 福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，福州350001

卵巢癌是一種惡性生殖器官腫瘤，嚴(yán)重威脅著許多婦女的健康和生命。雖然卵巢癌的研究越來(lái)越多，但其確切的分子機(jī)制仍未明確［1］。多項(xiàng)研究表明，表觀遺傳改變可能是許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制［2-3］。組蛋白去甲基化酶KDM2B基因編碼的蛋白包含JmjC結(jié)構(gòu)域、CXXC基序、PHD結(jié)構(gòu)域、富脯氨酸區(qū)域和富亮氨酸重復(fù)序列。其中，JmjC結(jié)構(gòu)域是催化H3K36me2和H3K4me3.28去甲基化的活性中心［4］。最近有研究表明，KDM2B通過(guò)JmjC依賴的方式調(diào)控基因表達(dá)，可能參與腫瘤發(fā)生［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去甲基化酶KDM2B在卵巢癌中的表達(dá)增加與組織學(xué)類型、腫瘤分級(jí)、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與EZH2呈正相關(guān)。Kdm2b可能成為卵巢癌診斷的潛在遺傳標(biāo)記物和臨床治療的新分子靶點(diǎn)［7］。目前Kdm2b基因在卵巢癌中發(fā)生發(fā)展的研究主要集中在細(xì)胞水平上，而在動(dòng)物模型中的研究少見(jiàn)，因此構(gòu)建Kdm2b基因敲除的動(dòng)物模型，可以促進(jìn)該基因在卵巢癌中的功能研究。

目前新型動(dòng)物模型構(gòu)建常用基因編輯方法有三種：鋅指核酸酶技術(shù)（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALEN）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（CRISPR/Cas9）技術(shù)。ZFNs的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶結(jié)構(gòu)域的設(shè)計(jì)和模塊化裝配非常復(fù)雜且耗時(shí)，且成功率和平均突變率低；TALEN的結(jié)構(gòu)較大，轉(zhuǎn)染困難［8］；與ZFN、TALEN技術(shù)相比，CRISPR/Cas技術(shù)使用的是單一的酶，不僅不需要根據(jù)目標(biāo)序列的不同而改變，只需要設(shè)計(jì)一個(gè)特異的向?qū)NA（sgRNA）就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同靶基因位置的基因編輯，而且成本低廉、簡(jiǎn)便和高效。目前，利用CRIS?PR/Cas技術(shù)構(gòu)建的Kdm2b基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠還未見(jiàn)報(bào)道。2018年1月–2019年12月，我們采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了Kdm2b基因大片段敲除的小鼠模型，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠：C57BL/6小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。細(xì)胞：NIH3T3（福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）；菌和質(zhì)粒：pEASY Blunt Cloning Vector（TransGen），PX459（Addgene），Trans1-T1（TransGen），PX458（Addgene），Top10（Ta?KaRa），pBlueScript II KS Vector（STRATAGENE）；試劑：Lipo2000（Invitrogen），嘌呤霉素（Life technolo?gies），胎牛血清（Amresco），氨芐青霉素（上海生工），DMEM（GIBCO），質(zhì)粒提取試劑盒（ROCHE），T7E1（NEW ENGLAND Biolabs），青霉素/鏈霉素（Amres?co）。主要儀器：電泳槽（北京六一），凝膠電泳儀（北京六一），紫外凝膠成像系統(tǒng)（Syngene），PCR儀（5333型，Eppendorf），生物安全柜（HealForce），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo），相差倒置顯微鏡（CKX-41型，Olympus）。

1.2 小鼠Kdm2b基因sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建①設(shè)計(jì)sgRNA：在網(wǎng)站http：//crispr.mit.edu/中分別粘貼第7個(gè)外顯子5’端的內(nèi)含子序列和第9個(gè)外顯子3’端的內(nèi)含子序列；各尋找評(píng)分最高的兩個(gè)序列；在選定的序列5’端加入BbsI位點(diǎn)。Kdm2b的第7個(gè)外顯子的兩個(gè)sgRNA識(shí)別的靶序列分別命名為sgRNA5-1及sgRNA5-2（圖1）。第9個(gè)外顯子的兩個(gè)sgRNA識(shí)別的靶序列分別命名為sgRNA3-1及sgRNA3-2（圖1）。②構(gòu)建RNA（sgRNA）重組質(zhì)粒：根據(jù)所設(shè)計(jì)的序列，分別合成sgRNA核苷酸正反兩條 單 鏈，將sgRNA5-1、sgRNA5-2和sgRNA3-1、sgRNA3-2兩條單鏈退火（95℃、5 min，37℃、75 min）形成雙鏈結(jié)構(gòu)，將得到的雙鏈插入到已用BbsⅠ酶切后的線性pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX459）載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，用氨芐抗性的LB培養(yǎng)基平板篩選，挑取單克隆搖菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒作為PCR模板，以U6-F和sgRNA5-1-R、sgRNA5-2-R、sgRNA3-1-R、sgRNA3-2-R作為引物進(jìn)行PCR，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷sgRNA是否正確插入到PX459質(zhì)粒載體中。

圖1 Kdm2b基因的sgRNA的設(shè)計(jì)圖

1.3 Kdm2b基因大片段敲除最佳sgRNA重組質(zhì)粒組合的篩選將4種sgRNA的重組質(zhì)粒兩兩組合，形成四個(gè)sgRNA共同作用的組合，分別為sgRNA3-1和sgRNA5-1、sgRNA3-1和sgRAN5-2、sgRNA3-2和sgRNA5-1、sgRNA3-2和sgRAN5-2的重組質(zhì)粒組合。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將4種質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)入NIH3T3細(xì)胞中，24 h后進(jìn)行嘌呤霉素篩選，12 d后形成陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。收集陽(yáng)性克隆，并且提取基因組，對(duì)基因組進(jìn)行PCR，得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定是否成功敲除Kdm2b基因片段。設(shè)計(jì)鑒定引物（Kdm2b-5臂鑒定正向引物：GT?GCCCTCCTCTTACTCAGGTTTCG和反向引物：AT?GTGGAAGTCAGTGAAACAGCCCT；Kdm2b-3臂鑒定正向引物：GGCTACACCTTTTTCATCCCTTC和反向引物：ACCGACTATTACCTCCCTCATTG）。結(jié)果顯示，sgRNA3-1和sgRAN5-2共同轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，切割效率為7.2%；gRNA3-2和sgRAN5-2切割效率為11.5%；以上兩種質(zhì)粒組合能實(shí)現(xiàn)Kdm2b基因的大片段敲除。根據(jù)切割效率的比較，選取了sgRNA3-2和sgRAN5-2為Kdm2b基因 敲 除的最 佳組合。

1.4 Kdm2b基因大片段敲除小鼠模型的構(gòu)建對(duì)3～6周齡C57BL/6母鼠進(jìn)行誘導(dǎo)排卵，下午1～2點(diǎn)每只C57BL/6母鼠注射0.2 mL 25 U/mL孕馬血清促性腺激素（PMSG）；46～48 h后，每只C57BL/6母鼠注射0.1 mL 50 U/mL人絨毛膜促性腺激素（hCG）；在注射hCG之后的當(dāng)天晚上，將一只或者兩只處于發(fā)情期的C57BL/6母鼠與一只C57BL/6的公鼠合籠，第二天早晨檢查是否有交配后形成的陰道栓；如發(fā)現(xiàn)陰道栓說(shuō)明小鼠授精成功。處死母鼠，取出輸卵管并撕開(kāi)獲得受精卵，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄sgRNA3-2、sgRNA5-2和Cas9的mRNA，然后利用細(xì)胞質(zhì)顯微注射技術(shù)在小鼠原核期的受精卵胚胎中注射sgRNA和Cas9的mRNA。共注射了130個(gè)胚胎，注射后胚胎的存活率為53%。體外培養(yǎng)后的存活胚胎移植入假孕母鼠的輸卵管壺腹部。待小鼠出生1周左右，剪取裂解尾尖，用酚/氯仿法抽提尾尖中的基因組DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序。純合子小鼠在初生4周后，觀察其表型。

2 結(jié)果

最終獲取13只小鼠。經(jīng)過(guò)鼠尾DNA鑒定，Kdm2b基因大片段缺失的純合子小鼠有1只，雜合子小鼠有3只，另外9只Kdm2b基因未見(jiàn)缺失；進(jìn)一步測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在Kdm2b基因中缺失的片段為外顯子7至外顯子9序列（圖2）。純合子小鼠在初生4周后，出現(xiàn)卷尾（圖3）。

圖2 Kdm2b基因大片段敲除小鼠鼠尾基因組的測(cè)序圖

圖3 Kdm2b基因大片段敲除小鼠

3 討論

轉(zhuǎn)基因小鼠模型是致癌機(jī)制研究的有效工具，將極大地豐富對(duì)卵巢癌發(fā)病機(jī)制和分子機(jī)制的研究。轉(zhuǎn)基因小鼠是表達(dá)外源基因或DNA序列的小鼠品系。改變小鼠基因組的常用方式有兩種：①傳統(tǒng)同源重組：將外源基因（帶有同源臂片段和抗性篩選基因）電轉(zhuǎn)染到胚胎干細(xì)胞中，通過(guò)攜帶的抗性進(jìn)行篩選，選擇陽(yáng)性的胚胎干細(xì)胞顯微注射到囊胚腔中，再將其移入假孕母體子宮內(nèi)，得到嵌合體小鼠。經(jīng)過(guò)多次雜交繁育可獲得純合個(gè)體。但是同源重組在體細(xì)胞中發(fā)生的概率非常低，只能達(dá)到10-6，所以只應(yīng)用在胚胎干細(xì)胞中［9］。②新型的基因編輯技術(shù)：是利用非同源性末端連接修復(fù)機(jī)制和隨后觸發(fā)同源重組機(jī)制，將基因編輯需要的組分直接顯微注射到受精卵后，移植到假孕母體的輸卵管中，待其發(fā)育成個(gè)體即為雜合子或者是純合子，不用進(jìn)行多次的雜交繁育?？茖W(xué)家可以直接將CRISPR系統(tǒng)注入受精卵和單倍體胚胎干細(xì)胞，而不是胚胎干細(xì)胞，以縮短繁殖時(shí)間。與ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有簡(jiǎn)便、基因編輯效率高等特點(diǎn)，已經(jīng)成功用于果蠅、斑馬魚(yú)、小鼠和人等物種中［10］。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究人員巧妙將細(xì)菌和古細(xì)菌中用來(lái)抵御外來(lái)噬菌體入侵的機(jī)制運(yùn)用到基因編輯中一種新型的基因編輯技術(shù)，通過(guò)sgRNA介導(dǎo)核酸酶Cas9對(duì)基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別、切割，激活細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接修復(fù)，引發(fā)移碼突變實(shí)現(xiàn)靶基因的敲除［11］。非同源端連接（NHEJ）是一種容易出錯(cuò)的修復(fù)機(jī)制，經(jīng)常導(dǎo)致插入或刪除（in?del）。這些indels可導(dǎo)致移碼突變、過(guò)早的停止密碼子或（和）非意義介導(dǎo)的靶基因衰退，從而導(dǎo)致功能喪失。而兩個(gè)sgRNA同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的大片段敲除。

本研究使用PX459質(zhì)粒作為載體，根據(jù)Kdm2b基因5’端和3’端DNA序列設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA。在進(jìn)行構(gòu)建基因敲除小鼠前，首先，需要檢測(cè)sgRNA的可行性和效率，并且篩選有效的切割組合。為了減少工作量，這個(gè)過(guò)程在NIH3T3細(xì)胞中先進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)表明，組合sgRNA3-2和sgRNA5-2能夠在細(xì)胞中成功地實(shí)現(xiàn)Kdm2b基因大片段敲除，并且效率最高。因此，篩選得到最佳組合是sgRNA3-2和sgRNA5-2。最后，將sgRNA3-2和sgRNA5-2組合注射到小鼠中，成功獲得Kdm2b基因大片段敲除小鼠。據(jù)文獻(xiàn)［12］報(bào)道，Kdm2b基因敲除可致小鼠出現(xiàn)顱面部發(fā)育不全、腦癱和低外顯率的卷尾。本研究中的純合子小鼠生長(zhǎng)到4周時(shí)，出現(xiàn)了卷尾的表現(xiàn)，進(jìn)一步支持Kdm2b基因大片段敲除小鼠模型構(gòu)建成功。

總之，我們首次利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功制備了Kdm2b基因大片段敲除小鼠，為深入研究Kdm2b基因在卵巢癌的發(fā)生中的作用機(jī)制、確定藥物開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)提供了動(dòng)物模型。