糞菌移植結(jié)合噬菌體抵抗雛雞沙門(mén)氏菌感染的作用

王曦，任金瑞，朱見(jiàn)深，李均同，吳香菊，戴美學(xué)，叢曉燕，侯云峰，呂強(qiáng)華，劉玉慶，杜以軍，齊靜

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疾病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3.山東金鑄基藥業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 271100）

腸炎沙門(mén)氏菌是養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)中一種重要致病菌，可引起早期雛雞大量死亡，在30日齡以后轉(zhuǎn)為隱性攜帶而難以致死，但伴隨著持續(xù)性排菌，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1，2］。抗生素是養(yǎng)殖企業(yè)防治沙門(mén)氏菌的常用手段，但是抗生素的濫用導(dǎo)致大量耐藥菌的出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全［3，4］。隨著《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃（2017—2020年）》的出臺(tái)，一些具有減抗或降抗?jié)摿Φ募夹g(shù)快速發(fā)展，如糞菌移植（fecalmicrobiota transplantation）和噬菌體（phage）療法。

糞菌移植是將健康供體腸道中的功能菌群移植給患病受體，幫助患病受體重新建立腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到治療疾病、促進(jìn)受體健康的目的［5］。已有研究表明糞菌移植可用于治療腸道相關(guān)疾病，清除大部分抗藥性機(jī)會(huì)致病菌（如人的復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染和潰瘍性結(jié)腸炎）［6］；促進(jìn)宿主健康并提高其抗病能力［7］。其中健康安全的供體是糞菌移植中一個(gè)重要的基礎(chǔ)和前提［8］。

噬菌體是一種特異性侵染細(xì)菌并利用宿主的代謝機(jī)制進(jìn)行復(fù)制的病毒，且不會(huì)對(duì)宿主動(dòng)物體內(nèi)的正常微生物群產(chǎn)生負(fù)面影響［9］。因此，噬菌體療法在治療動(dòng)物致病菌感染方面具有較大優(yōu)勢(shì)［10］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，使用噬菌體療法可以有效降低沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致的試驗(yàn)雞的死亡率［11］。

有研究表明，將噬菌體與益生菌聯(lián)合使用比各自單獨(dú)應(yīng)用能夠更有效地減少雛雞中的沙門(mén)氏菌［12］。健康成年個(gè)體的腸道菌群亦可以作為益生菌加以利用［13，14］。成年SPF雞的腸道菌群安全、敏感，以其作為供體進(jìn)行糞菌移植可以降低受體雛雞中大腸桿菌的抗藥性水平［15］。但是由于SPF雞生活在封閉隔離的環(huán)境中，導(dǎo)致其腸道菌群較為單一，且利用SPF雞的糞菌移植在抵抗病原菌入侵方面的研究較少［16－18］，因此本試驗(yàn)采用糞菌移植與噬菌體結(jié)合療法，研究其對(duì)感染沙門(mén)氏菌的SPF雛雞的治療效果。其核心是:①給予幼齡動(dòng)物健康成年動(dòng)物的腸道菌群，使幼齡動(dòng)物提前具備一定抵抗病原菌入侵的能力；②當(dāng)幼齡動(dòng)物感染致病菌時(shí)，再使用噬菌體療法來(lái)配合治療。本研究旨在評(píng)估糞菌移植與噬菌體結(jié)合療法的安全性與應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞胚場(chǎng)，供體動(dòng)物為208日齡SPF成年雞2只，受體動(dòng)物為1日齡SPF雛雞160只，隨機(jī)分為4組，每組40只。Ca組:每只雞在1日齡時(shí)口服0.1 mL PBS緩沖液；在3日齡時(shí)口服0.1 mL腸炎沙門(mén)氏菌液，約6.2×108cfu。Cb組:每只雞在1日齡和3日齡時(shí)口服0.1 mL PBS緩沖液。FPa組:每只雞在1日齡時(shí)口服0.1 mL糞菌移植液；3日齡時(shí)，每只雞口服6.2×108cfu腸炎沙門(mén)氏菌液；攻毒2 h后，口服0.1 mL噬菌體混合液，約1.38×108pfu；8日齡時(shí)，每只雞再次口服等量的噬菌體混合液。FPb組:每只雞在1日齡時(shí)口服0.1 mL糞菌移植液；3日齡時(shí)，每只雞口服0.1 mL PBS緩沖液；2 h后，口服0.1 mL噬菌體混合液，約1.38×108pfu；8日齡時(shí)，每只雞再次口服等量的噬菌體混合液。接受糞菌移植與噬菌體的組統(tǒng)稱(chēng)為FP組；未接受糞菌移植與噬菌體的組統(tǒng)稱(chēng)為C組；攻毒的組統(tǒng)稱(chēng)為a組；未攻毒的組統(tǒng)稱(chēng)為b組。各組分別在隔離器內(nèi)隔離飼養(yǎng)至40日齡，正常飼喂雛雞飼料和飲水。

1.2 糞菌移植菌液的制備

無(wú)菌采集兩只成年SPF雞的新鮮盲腸內(nèi)容物放入50 mL無(wú)菌離心管中，以1∶10（g/mL）的比例與無(wú)菌PBS緩沖液（內(nèi)含10%的甘油）混合，振蕩均勻，1 800 r/min離心10 min，將離心后所得懸液經(jīng)滅菌三層濾布（紗布、0.2 mm濾布、0.1 mm濾布）過(guò)濾，最終獲得均一、棕色的糞菌移植供體菌液，直接用于糞菌移植；或置于－80℃凍存，使用之前在冰水浴中提前2～4 h融化，可用于糞菌移植操作。

1.3 腸炎沙門(mén)氏菌的制備

將實(shí)驗(yàn)室保存的腸炎沙門(mén)氏菌（ATCC 13076）解凍，用接種環(huán)蘸取一環(huán)在LB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)后置于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，獲得沙門(mén)氏菌單菌落。挑取單菌落置于裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)8 h左右，離心后棄上清，使用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌2次，分光光度計(jì)初測(cè)OD600值，適當(dāng)稀釋使OD600在1.0左右，菌液濃度約為109cfu/mL。隨后用PBS緩沖液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)梦⒘科桨逑♂尫ǎ?9］精確計(jì)算攻毒菌液的實(shí)際劑量為每只雞6.2×108cfu。

1.4 噬菌體的制備及效價(jià)測(cè)定

選擇實(shí)驗(yàn)室分離保存的兩株沙門(mén)氏菌噬菌體（編號(hào)為2－2G和3G），參照文獻(xiàn)［20］中的方法進(jìn)行活化富集，利用雙層平板法測(cè)得2－2G的效價(jià)為8.6×108pfu/mL，3G的效價(jià)為9.52×109pfu/mL。吸取等量的兩種噬菌體液置于同一個(gè)離心管中振蕩混勻后，檢測(cè)其混合效價(jià)為1.38×109pfu/mL。

1.5 生存曲線(xiàn)及體重測(cè)定

每天觀察并記錄試驗(yàn)雞的生存狀況，繪制生存曲線(xiàn)。在第11、19、40日齡時(shí)每組隨機(jī)選擇4只雞，稱(chēng)量體重，記錄體重的變化情況。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

將第11、19、40日齡每組隨機(jī)采集的4只SPF雞經(jīng)頸動(dòng)脈放血致死，收集血液，分離血清，并無(wú)菌剖檢，采集空腸和肝臟組織，分別進(jìn)行如下指標(biāo)的檢測(cè)。

1.6.1 細(xì)胞因子檢測(cè) 將收集的血液在4℃冰箱靜置24 h，4 000 r/min離心8 min，收集血清，－20℃保存。使用江蘇晶美生物科技有限公司生產(chǎn)的雞白細(xì)胞介素1β（IL－1β）、雞白細(xì)胞介素18（IL－18）和雞γ干擾素（IFN－γ）ELISA試劑盒檢測(cè)3個(gè)日齡各組SPF雞血清中3種細(xì)胞因子的變化，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.2 腸道絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度以及肝臟病理變化 將收集的空腸（鄰近回腸的部分，約1 cm）和肝臟組織（每只雞無(wú)菌取指甲大小2片）分別放入盛有1 mL多聚甲醛的離心管中進(jìn)行固定，送武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行病理切片的制備，檢測(cè)3個(gè)日齡各組SPF雞的腸道絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度，并描述肝臟的病理變化。

1.6.3 肝臟組織中沙門(mén)氏菌的定性檢測(cè) 在40日齡，各組無(wú)菌采集步驟1.6中2只SPF雞的肝臟組織，利用DNA提取試劑盒（BioFlux）提取肝臟組織中總DNA，用PCR方法對(duì)各組肝臟組織中沙門(mén)氏菌進(jìn)行定性檢測(cè)。用于鑒定沙門(mén)氏菌的目的基因?yàn)镕imW基因，引物序列［21］如表1所示，由生工生物（上海）工程股份有限公司合成。

表1 擴(kuò)增腸炎沙門(mén)氏菌FimW基因的PCR引物序列

PCR擴(kuò)增體系（16μL）:2×TaqPCR Master-Mix緩沖液8μL，上游與下游引物各1μL，無(wú)菌去離子水4μL，DNA模板2μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并測(cè)序，分析沙門(mén)氏菌在肝臟中的定殖情況。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用軟件GraphPad Prism 7.0繪制生存曲線(xiàn)，利用Mann－Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生存曲線(xiàn)與體重變化

3日齡進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌攻毒之后，Ca組在5日齡至13日齡共死亡13只，30日齡時(shí)死亡1只，之后無(wú)死亡現(xiàn)象，除去試驗(yàn)期間處死的12只，最后Ca組剩余14只存活；其他3組均無(wú)死亡現(xiàn)象（圖1A）?？傮w來(lái)看，Ca組受沙門(mén)氏菌攻毒的影響較大，體重較其他組更低。在11日齡和19日齡，F(xiàn)Pb組體重顯著高于C組（P＜0.05）；40日齡時(shí)，F(xiàn)P組與Cb組的體重?zé)o顯著差異（P＞0.05），但三者體重均顯著高于Ca組（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 各組SPF雞的生存曲線(xiàn)與體重變化

2.2 血清細(xì)胞因子變化

在11日齡和40日齡，Ca組SPF雞血清中的IFN－γ濃度顯著高于其他3組（P＜0.05），且FP組與Cb組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；只有Ca組血清中IFN－γ濃度隨著日齡的增加而顯著增加（P＜0.05），其他3組隨著日齡的增加無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖2A）。11日齡至40日齡，Ca組的IL－1β濃度顯著高于b組（P＜0.05），F(xiàn)Pa組與Ca組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；各組血清中IL－1β的濃度隨著日齡的推移無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖2B）。11日齡和19日齡，Ca組中IL－18的濃度顯著高于Cb組（P＜0.05），b組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），40日齡時(shí)各組中IL－18的濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05）；Ca組IL－18濃度隨日齡推移而顯著下降（P＜0.05），其他3組IL－18濃度隨著日齡推移無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖2C）。

圖2 3個(gè)日齡3種細(xì)胞因子的比較

2.3 肝臟病理變化分析

Cb組和FPb組的肝臟組織切片中未觀察到明顯的病變（圖3A－F）。FPa組只在11日齡局部可見(jiàn)淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)（黑色箭頭，圖3G），19日齡和40日齡時(shí)沒(méi)有觀察到病變（圖3H、I）。在11、19、40日齡時(shí)，Ca組的肝臟組織中均可見(jiàn)明顯的淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)（黑色箭頭，圖3J－L）。

圖3 各組SPF雞肝臟病理切片（200×）

2.4 肝臟中沙門(mén)氏菌的定殖檢測(cè)

PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖4）表明，只有Ca組出現(xiàn)了目的條帶，且測(cè)序結(jié)果與目的條帶大小一致，說(shuō)明在40日齡時(shí)，除Ca組外，其它3組肝臟中均沒(méi)有腸炎沙門(mén)氏菌的定殖。

圖4 40日齡各組SPF雞肝臟中沙門(mén)氏菌的定性檢測(cè)

2.5 腸道絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度分析

在3個(gè)日齡中，C組間的腸道絨毛長(zhǎng)度始終無(wú)顯著差異（P＞0.05），F(xiàn)P組間的腸道絨毛長(zhǎng)度也無(wú)顯著差異（P＞0.05）。11日齡時(shí)，各組間的腸道絨毛長(zhǎng)度無(wú)顯著差異（P＞0.05）；19日齡和40日齡時(shí)，F(xiàn)P組的腸道絨毛長(zhǎng)度均顯著高于C組（P＜0.05）。FP組的腸道絨毛長(zhǎng)度隨著日齡的增加而顯著增加（P＜0.05），而C組的腸道絨毛長(zhǎng)度隨著日齡的增加無(wú)顯著變化（P＞0.05，圖5A）。隨著日齡的推移，Ca組的隱窩深度逐漸高于Cb組（P＜0.05），各組的隱窩深度隨著日齡的增加而降低（圖5B）。各組腸道絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度的比值（V/C）如圖5C所示，在11日齡，各組間的V/C值無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在19日齡，Cb組和FP組間的V/C值無(wú)顯著差異（P＞0.05），且都顯著高于Ca組（P＜0.05）；40日齡，F(xiàn)P組的V/C值顯著高于Ca組（P＜0.05），Cb組的V/C值與其他3組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。各組V/C值均隨著日齡的增加而增加。

圖5 3個(gè)日齡下的腸道絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度

3 討論

從各組受體動(dòng)物表現(xiàn)上來(lái)看，糞菌移植與噬菌體的結(jié)合療法有效降低了感染沙門(mén)氏菌的雛雞死亡。11日齡和19日齡時(shí)，F(xiàn)Pb組的體重顯著高于C組（P＜0.05），表明糞菌移植與噬菌體的結(jié)合療法對(duì)SPF雛雞的生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用。40日齡時(shí)，F(xiàn)P組與Cb組的體重?zé)o顯著差異（P＜0.05），且都顯著高于Ca組（P＜0.05），3個(gè)日齡Ca組的體重始終低于其他組。這表明腸炎沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致了SPF雛雞生長(zhǎng)速率變慢，而糞菌移植與噬菌體結(jié)合療法使感染腸炎沙門(mén)氏菌的雛雞體重恢復(fù)到正常水平。

腸炎沙門(mén)氏菌入侵會(huì)刺激機(jī)體中促炎因子與趨化因子分泌的增加，如:IL－1β、IL－18和IFN－γ等［22］。本研究中，腸炎沙門(mén)氏菌的入侵促進(jìn)了動(dòng)物體內(nèi)IFN－γ、IL－1β和IL－18的釋放。3個(gè)日齡中，b組間3種細(xì)胞因子的濃度基本無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明糞菌移植與噬菌體的結(jié)合治療并沒(méi)有引起SPF雞全身的炎癥反應(yīng)。11日齡和40日齡，F(xiàn)Pa組IFN－γ的濃度顯著低于Ca組（P＜0.05）；11日齡至40日齡，F(xiàn)Pa組中IL－1β的濃度與Ca組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；11日齡，F(xiàn)Pa組中IL－18的濃度顯著低于Ca組（P＜0.05），19日齡至40日齡，Ca組IL－18的濃度下降，與FPa組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這可能是因?yàn)榧S菌移植與噬菌體的結(jié)合療法對(duì)SPF雛雞的免疫能力起到了一定增強(qiáng)作用。

沙門(mén)氏菌的感染不限于腸道，它們能夠存在于巨噬細(xì)胞豐富的肝臟中［23］，并引起肝臟組織損傷，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)與灶性病變［24］。本研究中Ca組3個(gè)日齡的肝臟均出現(xiàn)了炎性病變，F(xiàn)Pa組只在11日齡發(fā)現(xiàn)炎性病變，說(shuō)明糞菌移植與噬菌體的結(jié)合療法減少了沙門(mén)氏菌導(dǎo)致的雛雞肝臟的炎性病變。

通過(guò)收集雛雞肝臟樣品進(jìn)行檢測(cè)是沙門(mén)氏菌感染的常規(guī)診斷方法之一［25］。通過(guò)對(duì)各組SPF雞40日齡的肝臟進(jìn)行DNA提取和PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只有在Ca組中檢出沙門(mén)氏菌特有的FimW基因。這表明糞菌移植與噬菌體的結(jié)合療法清除了腸炎沙門(mén)氏菌在肝臟中的定殖，起到了抵抗腸炎沙門(mén)氏菌感染的作用。

腸道絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度和絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度的比值可用來(lái)比較各組SPF雞的消化吸收能力［26］。本研究中FP組的腸道絨毛長(zhǎng)度及其與隱窩深度的比值均隨著日齡的推移顯著高于Ca組（P＜0.05）；與其他3組相比，Ca組的隱窩深度在3個(gè)日齡均處于最高水平。這表明腸炎沙門(mén)氏菌的感染抑制了SPF雛雞腸道絨毛的生長(zhǎng)以及導(dǎo)致隱窩深度增高，而糞菌移植與噬菌體的結(jié)合療法不僅改善了感染沙門(mén)氏菌的雛雞腸道絨毛的發(fā)育情況，還能促進(jìn)正常雛雞腸道絨毛的生長(zhǎng)，增強(qiáng)了雛雞消化吸收能力。

4 結(jié)論

本研究表明糞菌移植與噬菌體的結(jié)合療法在一定程度上提高了雛雞的免疫水平，減少了因感染沙門(mén)氏菌導(dǎo)致的雛雞肝臟的炎性病變，清除了沙門(mén)氏菌在肝臟中的定殖，增強(qiáng)了雛雞的消化吸收能力，降低了死亡率，促進(jìn)了體重增長(zhǎng)，保護(hù)了雛雞度過(guò)幼齡虛弱期，是減少抗生素使用的可行途徑，為糞菌移植與噬菌體的結(jié)合療法在抵抗動(dòng)物病原菌的感染方面提供了參考依據(jù)。