山東一規(guī)?；H場主要細(xì)菌病的流行病學(xué)與防控研究

朱曼玲，齊鵬飛，丁召亮，劉文強(qiáng)，程國明，楊宏軍，王長法，張偉

（1.聊城毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東 聊城 252000；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100；3.山東東阿黑毛驢牧業(yè)科技有限公司，山東 聊城 252000；4.東營市畜牧獸醫(yī)站，山東 東營 257091）

山東省規(guī)?；H場存欄量占全省驢存欄總量的80%左右，其組織化、規(guī)?；潭染尤珖傲小Ｒ?guī)?；B(yǎng)驢比傳統(tǒng)分散養(yǎng)殖在飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)調(diào)配、環(huán)境控制等方面均發(fā)生了較大變化，但在疫病防控、綠色生產(chǎn)等方面相對(duì)于其它畜禽的養(yǎng)殖水平仍有差距。驢駒腹瀉問題嚴(yán)重，導(dǎo)致繁殖率、生產(chǎn)性能下降，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖效益。為明晰集約化驢場細(xì)菌感染及流行狀況，為規(guī)?；H場提供科學(xué)防控策略，本試驗(yàn)于2018—2020年對(duì)山東一規(guī)?；H場進(jìn)行了系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查與研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料 從驢產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢聚集區(qū)山東聊城某規(guī)模化驢場采集新鮮的臨床組織病料液氮保存運(yùn)輸，腸道拭子4℃保存運(yùn)輸。

1.1.2 主要試劑 5%綿羊鮮血平板、營養(yǎng)肉湯瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、2×TaqPCR Master Mix、ddH2O、EasyPure?Bacteria Genomic DNA Kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL 2000 DNA Marker，購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離培養(yǎng) 將采集的冷藏病料組織置于超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)取病料組織內(nèi)部并接種至5%綿羊鮮血平板培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取優(yōu)勢單個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯瓊脂平板培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 OTUs聚類和物種分類分析 采用CTAB法提取樣品基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，備用。根據(jù)所擴(kuò)增的16S rDNA區(qū)域特點(diǎn)，構(gòu)建小片段文庫，基于Illumina NovaSeq測序平臺(tái)對(duì)該文庫進(jìn)行雙末端測序。對(duì)測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTU的代表序列做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況；同時(shí)對(duì)OTUs進(jìn)行豐度計(jì)算和花瓣圖等分析［1－3］。

1.2.3 小鼠致病性試驗(yàn) 將18～22 g的SPF級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，感染組每只注射0.2 mL（1.8×109cfu/mL）大腸桿菌菌懸液，健康對(duì)照組每只注射0.2 mL無菌PBS溶液，均采用腹腔注射方式。接種后在相同的環(huán)境下隔離飼養(yǎng)，觀察7 d，記錄臨床癥狀、死亡時(shí)間和數(shù)量。

1.2.4 剖檢小鼠與病理組織學(xué)觀察 對(duì)攻毒后死亡的小鼠剖檢觀察各組織臟器病變。取小鼠的病變臟器，制作石蠟切片，常規(guī)蘇木素－伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察攻毒后小鼠臟器的病理組織學(xué)變化。

1.2.5 疫病防控 針對(duì)驢駒出生20天后至斷奶期間出現(xiàn)的腹瀉突出問題，對(duì)4個(gè)圈舍的345頭驢（駒）連續(xù)2周不間斷進(jìn)行摸排，將發(fā)病的進(jìn)行特殊標(biāo)記編號(hào)，并灌服制劑一進(jìn)行治療。根據(jù)16S rDNA高通量測序結(jié)果，另選取出現(xiàn)腹瀉癥狀的驢駒60頭，體重50～60 kg，隨機(jī)分為4組，每組15頭。1組:制劑一（短小芽孢桿菌與植物乳桿菌等）加少量水溶解，灌服計(jì)量50×108cfu/頭，每天2次；2組:母子安散按照0.1 g/kg飼喂，每天2次；3組:白頭翁散按照0.1 g/kg灌服，每天2次；4組:10%鹽酸環(huán)丙沙星注射液，每10 kg體重肌肉注射1.25 mL，每天1次。治療周期為5天。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離和鑒定

本試驗(yàn)共分離大腸桿菌12株、志賀氏菌3株、克雷伯菌1株。參照其他物種致病性大腸桿菌毒力因子的檢測標(biāo)準(zhǔn)對(duì)驢源大腸桿菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其沒有K88、K99、937P和F41等毒力基因，采用MLST分型方法對(duì)分離到的菌株進(jìn)行分型，目前分離到的菌株主要有ST88、ST410和ST11390。

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

通過對(duì)樣品深度測序解析樣本中的病原RNA序列，結(jié)果表明:驢體內(nèi)微生物分為細(xì)菌（95%）、古細(xì)菌（3%）和病毒（2%）三大類。細(xì)菌隸屬于14門22綱41目71科119屬。在門水平上，樣本中細(xì)菌物種組成豐度較高的有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、脫鐵桿菌門、梭桿菌門、疣微菌門，其中豐度最高的是變形菌門和厚壁菌門（圖1）。在綱水平上，細(xì)菌物種豐度大于5%的有丙型變形菌綱、芽孢桿菌綱、梭菌綱，其中丙型變形菌綱是優(yōu)勢細(xì)菌物種。在目水平上，細(xì)菌物種豐度大于5%的有腸桿菌目、乳桿菌目。在科水平上，細(xì)菌物種豐度大于5%的有腸桿菌、鏈球菌科。在屬水平上，腸桿菌屬是優(yōu)勢菌屬。

圖1 Illumina NovaSeq測序結(jié)果

2.3 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

感染小鼠8 h后，試驗(yàn)組開始有精神沉郁表現(xiàn)，食欲降低，肛門有稀糞，并開始出現(xiàn)死亡，病死率為80%。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)與飲水采食均正常且無死亡現(xiàn)象。

2.4 剖檢與病理組織學(xué)檢測結(jié)果

剖檢死亡小鼠可見肝臟、肺臟明顯出血，腸道脹氣，導(dǎo)致腸壁變薄（圖2）。涂片鏡檢均可見病原菌，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)分離到的菌株與所接種菌株一致。

病理組織學(xué)觀察結(jié)果（圖3）顯示:心臟出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞纖維變性，肌間毛細(xì)血管出血，部分心肌纖維肌漿空泡化；肺組織出現(xiàn)肺泡壁斷裂，肺泡塌陷，肺泡及間質(zhì)充血、出血；肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，變性細(xì)胞胞漿淡染，其內(nèi)出現(xiàn)大小不等微小空泡，胞核懸于中央或偏于一側(cè)；門管區(qū)周圍肝細(xì)胞呈片狀壞死，壞死細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)粉染，胞核固縮、碎裂或溶解。

2.5 診療結(jié)果

采用制劑一治療后2周內(nèi)，總體發(fā)病率從開始的42.3%降至18.8%（表1）。治愈率3組（白頭翁散）＞1組（制劑一）＞4組（乳酸環(huán)丙沙星注射液）＞2組（母子安散）（表2）。

表1 驢（駒）發(fā)病數(shù)與發(fā)病率統(tǒng)計(jì)

表2 各處理治療效果對(duì)比

3 討論與結(jié)論

近幾年，隨著國家對(duì)發(fā)展草食畜牧業(yè)的大力支持，作為典型草食畜牧業(yè)的特色驢養(yǎng)殖得到迅速發(fā)展，逐漸從役用轉(zhuǎn)向食用，但由于起步較晚，與其他畜禽規(guī)?；曫B(yǎng)場的精細(xì)飼養(yǎng)、生產(chǎn)效率仍有差距。本研究明確了目前從散養(yǎng)向規(guī)?；B(yǎng)殖過渡期危害驢場生產(chǎn)、導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失最主要的疫病是細(xì)菌病，條件性致病菌是主要病原，發(fā)生率多數(shù)與驢舍環(huán)境、養(yǎng)殖密度、飼料質(zhì)量和管理水平等有直接關(guān)系。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒RNA含量中尾噬菌體目占比最高（27%），其次分別為皰疹病毒目（17%）、反轉(zhuǎn)錄病毒目（9%）、負(fù)鏈RNA病毒目（8%）、痘病毒科（7%）等，但只占總檢出病原的2%。細(xì)菌病給驢的規(guī)?；B(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，規(guī)?；B(yǎng)殖條件下如何科學(xué)防控細(xì)菌病值得關(guān)注［4－9］。

綜合在其他規(guī)?；H場的采樣分析，細(xì)菌性病原導(dǎo)致的腹瀉在養(yǎng)殖場普遍發(fā)生，主要致病菌包括大腸桿菌、志賀氏菌等。其中大腸桿菌是引起腸炎和敗血癥的主要病原，也是引起驢駒嚴(yán)重腹瀉、肺炎，造成驢駒大量死亡的原因，病死率為20%左右［10］。參照其他物種致病性大腸桿菌毒力因子的檢測標(biāo)準(zhǔn)對(duì)驢源大腸桿菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其沒有K88、K99、937P等毒力基因，采用新的MLST分型方法對(duì)分離到的菌株進(jìn)行分型，目前分離到的菌株主要有ST88、ST410和ST11390。

隨著驢產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖越來越多，當(dāng)前疫病的發(fā)生也表現(xiàn)出多類型、復(fù)雜性等特征。為此，首先要做好預(yù)防，加強(qiáng)日常的飼養(yǎng)管理工作，定期對(duì)養(yǎng)殖場所進(jìn)行消毒，減少病菌的滋生環(huán)境和傳播途徑。嚴(yán)格按照《畜禽養(yǎng)殖場消毒技術(shù)》（NY/T3075—2017），做好不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的消毒工作，尤其是產(chǎn)房內(nèi)部清潔和消毒工作［11－13］。為保證消毒效果，要對(duì)消毒后的理化指標(biāo)、殺滅微生物效果指標(biāo)和毒理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)。

通過對(duì)當(dāng)前細(xì)菌性傳染病的防治方案療效和發(fā)病率比對(duì)，發(fā)現(xiàn)藥物療效易發(fā)生變化，細(xì)菌極易發(fā)生耐藥性，帶菌現(xiàn)象遷延不愈。因此需要及時(shí)調(diào)整措施科學(xué)防治［14－16］。經(jīng)過1年的用藥效果分析發(fā)現(xiàn)，首選氨基糖甙類如卡那霉素、新霉素，配合喹諾酮類合成的環(huán)丙沙星、恩諾沙星等沙星類藥物，而阿莫西林、頭孢類的β－內(nèi)酰胺類藥物使用后有耐藥性?？股乜墒褂毛F用硫酸卡那霉素注射液和乳酸環(huán)丙沙星注射液。必要時(shí)，服用蒙脫石、易蒙?；蝼匪岬鞍椎戎篂a劑。同時(shí)保證足夠的奶水、維生素、氨基酸和鹽離子，在控制住病原和腹瀉癥狀后，使用短小芽孢桿菌與植物乳桿菌等驢源腸道的益生菌進(jìn)行調(diào)理效果明顯。

目前有關(guān)驢的疫病國內(nèi)外研究較少，驢疫病相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究薄弱，缺乏主要疫病的監(jiān)測和系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，疫病的流行規(guī)律不清、病原的致病性及變異機(jī)理不明，尚未建立重要疫病病原變異與傳播的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系。本研究為驢場疫病的預(yù)防控制和凈化措施等提供了數(shù)據(jù)支撐。