蝦青素對(duì)db/db小鼠糖尿病腎病的保護(hù)作用

呂亭亭 桂定坤 葛聲

摘 要：目的：采用2型糖尿病模型db/db小鼠，觀察蝦青素對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用。方法：db/db小鼠糖尿病腎病模型成模后隨機(jī)分為：模型對(duì)照組、氯沙坦組、蝦青素低劑量組、蝦青素高劑量組進(jìn)行干預(yù)。同窩db/m小鼠作為正常對(duì)照。其中，氯沙坦組、蝦青素低劑量組、蝦青素高劑量組分別采用氯沙坦10 mg/（kg·d）BW、蝦青素30 mg/（kg·d）BW、蝦青素60 mg/（kg·d）BW進(jìn)行灌胃，氯沙坦與蝦青素均用橄欖油溶解，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組灌胃等量橄欖油。干預(yù)8w后，檢測(cè)其空腹血糖、OGTT、24 h尿白蛋白、尿ACR、肌酐、尿素氮等指標(biāo)。結(jié)果：低劑量蝦青素對(duì)糖耐量無不良影響，并能顯著降低血清尿素氮、尿蛋白、尿ACR水平。結(jié)論：低劑量蝦青素具有腎臟保護(hù)作用，但不具有劑量依賴性。

關(guān)鍵詞：蝦青素;糖尿病腎病;腎功能;抗氧化

糖尿病及其并發(fā)癥的防治已成為重要的公共衛(wèi)生問題[1-8]。蝦青素（astaxanthin，ASX）是一種類胡蘿卜素 [9]，天然蝦青素主要存在于藻類、三文魚、蝦、酵母菌等。蝦青素的生物學(xué)活性作用及健康效益是近年來醫(yī)學(xué)營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。大量的體內(nèi)、體外研究結(jié)果顯示，蝦青素具有預(yù)防黃斑變性[10]、改善皮膚皺紋[11]、改善血流動(dòng)力學(xué)[12]、預(yù)防冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病[13-14]、抑制腫瘤生長[15-17]等作用，其作用機(jī)制主要與抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫有關(guān)。蝦青素是單線態(tài)氧的猝滅劑，可以清除自由基，具有強(qiáng)大的抗氧化作用[18]，蝦青素的抗氧化能力是玉米黃素、葉黃素、角黃素、β-胡蘿卜素的10倍，是α-生育酚的100倍。高血糖引起的氧化應(yīng)激是引起糖尿病慢性并發(fā)癥的重要作用機(jī)制之一，前期研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素對(duì)高糖誘導(dǎo)的人足細(xì)胞早期凋亡和粘附功能具有保護(hù)作用[19]。本研究擬在動(dòng)物水平進(jìn)一步驗(yàn)證蝦青素對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

蝦青素，上海麟寶實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;氯沙坦，中國食品藥品檢定研究院;橄欖油，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;生理鹽水，上海君瑞生物技術(shù)有限公司;尿微量白蛋白試劑盒，Bethyl Laboratories;尿肌酐試劑盒，南京建成有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng) 6周齡雄性db/db小鼠20只，同窩雄性db/m小鼠5只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2010-0001;動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2011-0128。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：所有小鼠每籠5只，分籠飼養(yǎng)在清潔級(jí)（SPF）動(dòng)物房內(nèi)。SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)環(huán)境溫度為（25±2）℃，相對(duì)濕度50%～70%，每天予以12 h光照。實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠自由進(jìn)食和飲水，采用普通飼料喂養(yǎng)，每100 g普通飼料三大產(chǎn)能營養(yǎng)素供能比：碳水化合物 60%、脂肪19%、蛋白質(zhì)21%。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 db/db小鼠是由瘦素受體基因缺陷導(dǎo)致的先天肥胖性2型糖尿病小鼠模型。隨著時(shí)間發(fā)展會(huì)自發(fā)出現(xiàn)肥胖、高胰島素血癥、高血糖，一般8～9 w即可出現(xiàn)微量白蛋白尿，提示出現(xiàn)糖尿病腎病。將db/db小鼠隨機(jī)分為4組，每組各5只，即模型對(duì)照組（MG）、氯沙坦組（ARB）、蝦青素低劑量組（LASX）及蝦青素高劑量組（HASX）。同窩雄性db/m小鼠為正常對(duì)照組（NG）。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后，斷尾法測(cè)定其空腹血糖水平，收集尿液標(biāo)本，檢測(cè)尿微量白蛋白/肌酐，即尿ACR水平。根據(jù)空腹血糖和尿ACR水平判斷db/db小鼠糖尿病腎病的成模情況。實(shí)驗(yàn)干預(yù)階段，每早固定時(shí)間以橄欖油作為載體對(duì)小鼠灌胃。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組采用10 mL/（kg·d）BW橄欖油灌胃。氯沙坦組：氯沙坦10 mg/（kg·d）BW進(jìn)行灌胃;蝦青素低劑量組：蝦青素30 mg/（kg·d）BW;蝦青素高劑量組：蝦青素 60 mg/（kg·d）BW。蝦青素、氯沙坦均溶于橄欖油中，干預(yù)8 w。

1.2.3 標(biāo)本收集 尿液：將小鼠單只飼養(yǎng)在小鼠專用代謝籠內(nèi)，正常攝食和飲水。24 h后收集尿液，記錄24 h尿量。用離心機(jī)3 500 r/min離心10 min，棄去沉渣，取上清，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)量。血液：采用鹽酸氯胺酮麻醉動(dòng)物后，摘眼球取血進(jìn)行血液樣本收集，將收集好的血液用離心機(jī)5 000 r/min離心10 mg/（kg·d）BW，取上清至無菌EP管中保存。

1.3 方法

1.3.1 空腹血糖和OGTT 在小鼠禁食12 h后，鼠尾末端2～3 mm處剪斷尾巴，將第一滴血棄去，第二滴血滴在血糖試紙上，以測(cè)得空腹血糖。OGTT：對(duì)各組小鼠給予20%葡萄糖溶液2 g/kg進(jìn)行灌胃，同樣方法檢測(cè)0、30、60、120 min血糖，繪制血糖-時(shí)間曲線，并計(jì)算曲線下面積（AUC）。

1.3.2 腎功能及尿ACR測(cè)定 將采集的血液標(biāo)本分離出血清后，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐、尿素氮等指標(biāo)。采用ELISA法測(cè)定尿微量白蛋白及尿白蛋白。采用尿肌酐試劑盒（除蛋白法）測(cè)定尿肌酐水平，進(jìn)而計(jì)算出尿ACR（尿微量白蛋白/肌酐）。

1.3.3 腎組織透射電鏡標(biāo)本留取及檢測(cè) 將小鼠腎皮質(zhì)切成1 mm3的立方小塊。放入盛有4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中固定，4℃冷藏保存。用1%四氧化蛾后固定，逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂Epon 812包埋，聚合后切成1.5～2 μm厚片。制備光鏡半薄切片的包埋塊，并選相應(yīng)部位做超薄切片，采用H-500型電子顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件。采用one-way ANOVA的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 干預(yù)前各組空腹血糖、尿ACR水平

適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后，db/db小鼠出現(xiàn)明顯肥胖、并伴有多飲、多食、多尿癥狀。檢測(cè)其空腹血糖及尿ACR水平，結(jié)果顯示，db/db小鼠的空腹血糖和尿ACR均顯著高于db/m小鼠（表1），說明糖尿病腎病模型造模成功。

2.2 OGTT結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組0、30、120 min血糖均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其60 min血糖水平亦有較明顯升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氯沙坦組，蝦青素低劑量組各時(shí)間點(diǎn)血糖與模型對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而蝦青素高劑量組30、60、120 min血糖高于模型對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2），這表明，低劑量蝦青素對(duì)糖尿病腎病小鼠的血糖無不良影響，而高劑量蝦青素可能會(huì)對(duì)血糖控制產(chǎn)生不利影響。

2.3 腎功能的比較

血尿素氮與血肌酐是反應(yīng)腎功能的主要指標(biāo)。肌酐是人體肌肉的代謝產(chǎn)物，尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的主要產(chǎn)物，而腎臟是排泄這些代謝廢物的主要器官。當(dāng)腎功能受到損傷，對(duì)這些代謝廢物的排泄減少，則會(huì)導(dǎo)致尿素氮和肌酐在血液中的含量升高。本實(shí)驗(yàn)中，db/db小鼠的血肌酐水平與正常對(duì)照組相比有升高的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但其血尿素氮水平較正常對(duì)照組顯著升高，低劑量蝦青素干預(yù)可顯著降低其血尿素氮水平。高劑量蝦青素組與模型對(duì)照組相比，血尿素氮水平有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.4 尿ACR和24 h尿蛋白排泄量的比較

模型對(duì)照組的24 h尿白蛋白與尿ACR均顯著高于正常對(duì)照組，氯沙坦及高劑量蝦青素并未顯示出明顯的降低尿蛋白或者尿ACR的作用，而蝦青素低劑量組的24 h尿白蛋白及尿ACR與模型對(duì)照組相比顯著降低（表4）。

2.5 電鏡表現(xiàn)

電鏡下，正常對(duì)照組小鼠腎小球基底膜結(jié)構(gòu)清晰，足突排列整齊，分布均勻。而模型對(duì)照組腎臟結(jié)構(gòu)可見腎小球基底膜結(jié)構(gòu)欠清晰，走形僵硬，節(jié)段性增厚，亦可見足突廣泛融合，系膜細(xì)胞增生，基質(zhì)增生。蝦青素高劑量組及ARB組小鼠腎臟病理改善不明顯，而低劑量蝦青素組腎臟組織形態(tài)改善顯著，基底膜清晰，足突融合程度減輕，系膜區(qū)基質(zhì)增生程度有所緩解（附圖）。

3 討論

糖尿病腎病作為糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，以其較高的致殘率和致死率嚴(yán)重危害著廣大糖尿病患者的生活質(zhì)量和生命健康。糖尿病腎病主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿，進(jìn)行性腎功能損害和高血壓。蛋白尿的嚴(yán)重程度可以反映腎臟組織病變的程度，并會(huì)影響糖尿病腎病患者的生存率及預(yù)后。糖尿病腎病的病理改變主要為腎小球肥大，基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，足突融合等。系膜細(xì)胞作為腎小球固有細(xì)胞，增生后可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成過量并積聚，可導(dǎo)致腎小球硬化。高血糖引起的氧化應(yīng)激增強(qiáng)是造成糖尿病并發(fā)癥的重要病理生理機(jī)制之一[20]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，代謝異常（高血糖、血脂異常）和血流動(dòng)力學(xué)損傷（系統(tǒng)性和腎小球性高血壓）是造成糖尿病腎臟氧化應(yīng)激的兩個(gè)主要驅(qū)動(dòng)因素[21-22]。氧化應(yīng)激水平升高可增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促使腎小球肥大，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β1、纖連蛋白和Ⅳ型膠原等表達(dá)增加。因此，氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

C57BLKs/J背景的db/db小鼠是由于編碼瘦素受體基因的堿基發(fā)生點(diǎn)突變，導(dǎo)致小鼠攝食過量，發(fā)生胰島素抵抗，血糖水平升高，體型肥胖。并有研究表明，db/db小鼠易發(fā)生糖尿病腎病，表現(xiàn)為尿白蛋白升高，系膜細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)積聚，基底膜增厚等腎臟結(jié)構(gòu)破壞[23]，是公認(rèn)的研究2型糖尿病導(dǎo)致的糖尿病腎病的動(dòng)物模型。本研究結(jié)果顯示，蝦青素可以顯著降低db/db小鼠的尿蛋白水平，降低尿ACR，并改善其腎臟組織結(jié)構(gòu)，具有腎臟保護(hù)作用。這可能與蝦青素強(qiáng)大的抗氧化作用有關(guān)。但其腎臟保護(hù)作用不具有劑量依賴性，相反高劑量蝦青素反而對(duì)糖尿病腎病小鼠的糖耐量產(chǎn)生不利影響，對(duì)尿蛋白及尿ACR也未見明顯改善。這也提示，單純抗氧化營養(yǎng)素并不是越多越好，而是要達(dá)到平衡狀態(tài)。氧化劑是正常氧代謝的產(chǎn)物，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，衰老和退行性疾病中都起著重要作用。氧化劑在細(xì)胞生理學(xué)也是重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，而抗氧化劑可防止氧化劑過量積聚對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷。在健康人體中，氧化劑與抗氧化劑保持著復(fù)雜的平衡狀態(tài)。當(dāng)這種平衡狀態(tài)被打破，無論是朝著哪個(gè)方向，對(duì)機(jī)體都是不利的。

本研究中低劑量蝦青素呈現(xiàn)的腎臟保護(hù)效果令人鼓舞，但該實(shí)驗(yàn)尚存在許多不足之處，樣本量較小，并沒有深入探討其具體機(jī)制。在接下來的研究中應(yīng)該進(jìn)一步摸索抗氧化營養(yǎng)素最佳劑量，為通過氧化應(yīng)激平衡治療糖尿病腎病提供新的思路與基礎(chǔ)?！?/p>

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Protective Effect of Astaxanthin on Diabetic Nephropathy in db/db Mice

LYU Ting-ting，GUI Ding-kun，GE Sheng

（Shanghai 6th People’s Hospital，Shanghai 200000，China）

Abstract：Objective To observe the protective effect of astaxanthin on diabetic nephropathy on db/db mice.Method Diabetic nephropathy model db/db mice was randomly divided into model group，losartan group，low dose astaxanthin group，high dose astaxanthin group.db/m mice in the same nest were used as normal controls.Among them，losartan group，low-dose astaxanthin group and high-dose astaxanthin group were separately given losartan 10 mg/（kg·d）BW，astaxanthin 30 mg/（kg·d）BW and astaxanthin 60 mg/（kg·d）BW.Losartan and astaxanthin were dissolved by olive oil，so the normal control group and model control group were given the same amount of olive oil.After 8 weeks of intervention，fasting blood glucose，OGTT，24-hour urine albumin，urine ACR，creatinine，urea nitrogen and other indicators were detected.Result Low dose astaxanthin had no adverse effect on glucose tolerance，and could significantly reduce the levels of serum urea nitrogen，urine protein and urine ACR.Conclusion Low dose astaxanthin has renal protective effect，but not dose-dependent.

Keywords：astaxanthin;diabetic nephropathy;renal function;antioxidant