核桃分心木水提物抗疲勞作用研究

侯登勇 張建 何穎 羅群

摘 要：目的：研究核桃分心木水提物的抗疲勞作用，為其保健品開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法：制備分心木水提物并測(cè)定其總多糖、總多酚和總黃酮含量。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和分心木水提物低、中、高劑量組，連續(xù)灌胃14 d，測(cè)定小鼠的體重、臟器指數(shù)和負(fù)重游泳力竭時(shí)間，檢測(cè)血清乳酸（BLA）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿素氮（BUN）、肌肉和肝臟糖原含量，以及肝臟丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果：分心木水提物得率為（9.41%±0.82%），總多糖、總多酚、總黃酮含量分別為（33.40%±0.88%）、（30.80%±2.28%）、（24.62%±0.86%）。分心木水提物對(duì)小鼠的體重和臟器指數(shù)沒有明顯影響（P>0.05），能延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳力竭時(shí)間（P<0.01），并具有劑量依賴性，能降低小鼠BLA和BUN含量，提高LDH活性（P<0.01）。與空白對(duì)照組相比，給藥組小鼠運(yùn)動(dòng)后肝、肌糖原含量增加，肝臟MDA含量降低、SOD活性升高（P<0.01）。結(jié)論：分心木水提物能提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，具有抗疲勞作用。

關(guān)鍵詞：核桃;分心木;水提物;小鼠;抗疲勞

分心木是核桃中夾在核桃仁之間的木質(zhì)小薄片，體輕、質(zhì)脆、易折斷[1-2]，顏色呈棕色或棕褐色，味苦澀，性平，入脾、腎經(jīng)，具有固腎澀精功效，可以治療遺精、遺尿、多汗、瀉痢以及失眠多夢(mèng)等多種疾病[3-4]。藥理活性研究表明，分心木除具有補(bǔ)腎作用外，還具有抑菌、抗氧化等作用[5]。然而，人們食用或加工核桃時(shí)往往只利用了核桃仁，同時(shí)產(chǎn)生的大量分心木除了在少部分地區(qū)被用來泡茶喝外，絕大部分都被作為廢棄物處理，造成資源的極大浪費(fèi)[6]。分心木的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用對(duì)提高核桃附加值，減少浪費(fèi)具有重要意義。

疲勞可導(dǎo)致肌肉力量和耐力下降、運(yùn)動(dòng)技能表現(xiàn)下降、身體和心理功能下降等[7]，不僅會(huì)影響人們的日?；顒?dòng)，還可能會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生[8]。分心木能夠改善睡眠，固腎澀精，但目前尚未看到關(guān)于分心木抗疲勞方面的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了分心木水提物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、負(fù)重游泳后BLA、BUN含量和LDH活性的影響，測(cè)定了肝、肌糖原及肝臟MDA含量和SOD活性，為分心木在抗疲勞方面的保健品開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分心木，購自云南楚雄;肝糖原、肌糖原、BLA、BUN、LDH、MDA和SOD檢測(cè)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所;蘆丁和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國(guó)食品藥品檢定研究院;其他試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c小鼠（合格證編號(hào)：20130016006241），雄性，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)，購自海軍特色醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物中心。

1.3 儀器與設(shè)備

TB-214型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;JT502N型計(jì)重電子秤，上海精天電子儀器有限公司;5418R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;759型紫外-可見光分光光度計(jì)，上海奧譜勒儀器有限公司;354型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司;Lyolab-3000型真空冷凍干燥機(jī)，奧地利Heto-Hotten公司。

1.4 方法

1.4.1 分心木水提物的制備 稱取分心木1 000 g，用蒸餾水清洗干凈，加入10 L蒸餾水，浸泡2 h后，100 ℃加熱回流提取，提取時(shí)間為60 min。收集提取液，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃左右濃縮至200 mL，-70℃預(yù)凍6 h，-50℃真空冷凍干燥48 h，即得分心木水提物（AED）。

1.4.2 分心木水提物總黃酮含量測(cè)定 精確移取濃度為0.1 mg/mL分心木水提物溶液1 mL，置25 mL 的容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min;加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min;加4%氫氧化鈉溶液4 mL，加水稀釋至刻度線，搖勻，放置15 min，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（標(biāo)準(zhǔn)品為蘆?。┯?jì)算出樣品中總黃酮含量。

1.4.3 分心木水提物總多酚含量測(cè)定 精確移取濃度為0.1 mg/mL分心木水提物溶液1 mL，加入5.0 mL FolinCiocalteu試劑中，反應(yīng)4 min 后，加入4.0 mL 75 g/L 的Na2CO3 溶液，置室溫下反應(yīng)120 min，于760 nm 下測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（標(biāo)準(zhǔn)品為沒食子酸）計(jì)算總多酚的含量。

1.4.4 分心木水提物總多糖含量測(cè)定 精確移取濃度為0.1 mg/mL分心木水提物溶液1 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液和5 mL 濃硫酸，沸水浴中加熱15 min 后冷卻，于490 nm下測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（標(biāo)準(zhǔn)品為葡萄糖）計(jì)算樣品中總多糖的含量。

1.4.5 動(dòng)物分組及給藥 Balb/c小鼠80只，雄性，根據(jù)體重隨機(jī)分為4組，每組20只，分別為空白對(duì)照組 （CG）、低劑量組 （LDG）、中劑量組（MDG）、高劑量組（HDG）。CG組以生理鹽水灌胃，LDG組劑量為125 mg/kg，MDG組劑量為250 mg/kg，HDG組劑量為500 mg/kg。各組小鼠每天稱重，灌胃給藥，0.1 mL/10 g，連續(xù)14 d。各組小鼠在灌胃期間自由取食和飲水[9]。

1.4.6 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn) 每組隨機(jī)挑選10只小鼠，于末次灌胃2 h后，在小鼠尾巴根部負(fù)荷8%體重的鉛皮，放入水池中游泳，水深30 cm，水溫25.0℃，如出現(xiàn)漂浮水面休息的情況，則不斷用玻璃棒撥動(dòng)小鼠強(qiáng)迫游泳，直到力竭為止。記錄自游泳開始至頭部全部沉入水中 10 s不能浮出水面的時(shí)間為小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間。休息10 min后，頸椎脫臼處死，解剖取肝臟、腎臟、心臟和脾臟，稱重，計(jì)算各臟器指數(shù)。

1.4.7 小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè) 各組剩余的10只小鼠，末次灌胃2 h后，在小鼠尾巴根部負(fù)荷3%體重的鉛塊，放入水池中強(qiáng)迫游泳，游泳20 min后，取出小鼠，烘干體表水分。放回原籠休息10 min后，摘眼球取血，4℃放置4 h后2 500 r/min 離心，取血清，按試劑盒說明書測(cè)定BLA、BUN、LDH含量。

1.4.8 小鼠肝、肌糖原和肝組織中MDA含量和SOD活性的測(cè)定 將取血后的小鼠頸椎脫臼處死。取肝臟和股四頭肌組織各200 mg，加入2 mL生理鹽水進(jìn)行勻漿，以4 000 r /min離心10 min 后取上清液。按試劑盒說明書測(cè)定肝糖原、肌糖原含量和肝組織中MDA含量和SOD活性。

1.4.9 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（±s）表示，采用軟件SPSS 18進(jìn)行單因素方差分析，P <0.05 為差異顯著、P<0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 分心木水提物主要成分含量測(cè)定

經(jīng)水提、濃縮、真空冷凍干燥后得深褐色分心木水提物，提取率為（9.41%±0.82%）。按方法部分所述測(cè)定分心木水提物中的總黃酮、總多糖和總多酚含量。結(jié)果顯示，分心木水提物中總黃酮含量為（33.40%±0.88%）、總多糖含量為（30.80%±2.28%）、總多酚含量為（24.62%±0.86%）。

2.2 分心木水提物對(duì)小鼠體重和臟器指數(shù)的影響

如表1所示，3個(gè)給藥組小鼠的體重與空白對(duì)照組相比無明顯變化（P>0.05）。表2所示，各組小鼠的肝臟、心臟、腎臟、脾臟和胸腺的臟器指數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析沒有明顯差別（P>0.05），這表明分心木提取物對(duì)小鼠體重和臟器沒有明顯影響。

2.3 分心木提取物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

末次灌胃2 h后，小鼠負(fù)重游泳，記錄游泳時(shí)間，結(jié)果如圖1所示。與空白對(duì)照組相比，分心木提取物低中、高劑量都能顯著提高小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間（P<0.01），且具有一定的劑量依賴性，說明分心木水提物能夠增加小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，提高小鼠的抗疲勞耐受力。

2.4 分心木水提物對(duì)小鼠BLA、LDH和BUN的影響

小鼠游泳20 min，休息10 min后，眼球取血測(cè)定血清乳酸和尿素氮濃度以及乳酸脫氫酶的活性。如表3所示，3個(gè)劑量組小鼠的BLA含量都非常明顯低于空白對(duì)照組（P<0.01）。與空白對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠血清乳酸脫氫酶活性均明顯升高（P<0.01）。3個(gè)劑量組小鼠BUN含量與空白對(duì)照組相比，分別下降了17.21%、25.05%、31.82%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.5分心木提取物對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原的影響

小鼠負(fù)重游泳后處死，取肝臟和肌肉組織，勻漿后按試劑盒說明測(cè)定糖原含量，結(jié)果如表4所示。分心木水提物給藥組小鼠體內(nèi)的肝糖原和肌糖原含量都比空白對(duì)照組小鼠非常明顯增多（P<0.01），表明分心木水提物能提高小鼠肝臟和肌肉組織中的糖原儲(chǔ)備量，提供更多的能量，從而增加小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

2.6 分心木水提物對(duì)小鼠肝臟組織中MDA含量和SOD活性的影響

肝臟組織勻漿后，按試劑盒說明書測(cè)定MDA含量和SOD活性，結(jié)果如表5所示。與空白對(duì)照組比較，分心木水提物給藥組小鼠肝臟組織中MDA的含量非常明顯降低（P<0.01）。3個(gè)劑量組小鼠肝臟組織中的SOD活性均非常明顯高于空白對(duì)照組小鼠（P<0.01）。結(jié)果說明分心木水提物能夠提高小鼠的抗氧化能力。

3 討論

研究表明，分心木中含有黃酮[9-12]、多糖[13]和多酚類[14]物質(zhì)。本研究中分心木的水提物提取率為9.4%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。分心木水提物中總黃酮的含量為33.40%，低于文獻(xiàn)報(bào)道中60%乙醇提取物中的含量42.19%[15]，原因可能是黃酮在乙醇溶液中的溶解度大于水溶液。分心木水提物中總多糖與總多酚含量分別為34.91%和24.62%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14，16]。每天灌胃給于小鼠分心木水提物14 d后，各組小鼠的體重沒有明顯差異，說明分心木水提物對(duì)小鼠的正常飲食沒有影響。各組小鼠的臟器指數(shù)沒有明顯差別，說明分心木水提物在給藥劑量范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)小鼠各臟器產(chǎn)生不利影響。文獻(xiàn)報(bào)道分心木水提物的小鼠急性毒性LD50為21.5 g/kg[17]，而本研究的最高劑量為0.5 g/kg，為L(zhǎng)D50的2.32%，是非常安全的。負(fù)重游泳力竭時(shí)間是反映小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的最直觀的指標(biāo)，與機(jī)體的抗疲勞能力呈正相關(guān)[18-19]。分心木水提物能夠明顯延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳力竭時(shí)間，提高小鼠的抗疲勞能力。機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)所需能量主要由無氧代謝供給，無氧代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，血液中乳酸含量和清除乳酸的乳酸脫氫酶活性是評(píng)價(jià)機(jī)體疲勞和抗疲勞能力的重要指標(biāo)[20]。血尿素氮含量可反映蛋白質(zhì)分解代謝和對(duì)運(yùn)動(dòng)耐受性的程度，當(dāng)疲勞產(chǎn)生時(shí)尿素氮含量也隨之增加[21]。肝糖原是一個(gè)反應(yīng)疲勞狀態(tài)較敏感的指標(biāo)。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌糖原消耗不斷增加，肝糖原儲(chǔ)備減少以維持血糖水平[22]。本研究結(jié)果顯示，分心木水提物能明顯降低小鼠血清乳酸含量，增加血清中乳酸脫氫酶的活性，降低小鼠血清尿素氮含量，提高小鼠體內(nèi)的肝、肌糖原含量，具有明顯的抗疲勞效果。

劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)使體內(nèi)產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基和活性氧，與DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等生物大分子反應(yīng)，生成脂質(zhì)過氧化物（MDA），造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使機(jī)體功能下降并產(chǎn)生疲勞感。SOD是體內(nèi)清除超氧陰離子自由基和活性氧的最重要的酶。分心木水提物能夠明顯增加小鼠肝臟中的SOD活性，降低MDA含量，提高小鼠的抗氧化能力，這可能是分心木提高小鼠抗疲勞能力的主要機(jī)理之一。另外，分心木具有催眠安神和固腎澀精的功效，可能也是其具有抗疲勞作用的重要原因?！?/p>

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Anti-fatigue Activity Study of Aqueous Extract from Diaphragma juglandis Fructus in Walnut

HOU Deng-yong，ZHANG Jian，HE Ying，LUO Qun

（Navy medical center of PLA，Shanghai 200433，China）

Abstract：Objective To determine the anti-fatigue activity of aqueous extract from Diaphragma juglandis Fructus （AED）in walnut，and set base for further application of the extract.Method Diaphragma juglandis Fructus was extracted with water under reflux.The extracting liquid was concentrated and lyophilized.The total polysaccharides，polyphenol and flavonoid in AED were measured.Mice were randomly divided into control group，low dose AED group，middle dose AED group and high dose AED group.After AED was orally administered to mice continuously for 14 days，the body weight，organ index，load swimming time，blood lactic acid （BLA），blood urea nitrogen （BUN），serum lactate dehydrogenase （LDH），hepatic and muscle glycogen，hepatic malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）activity of the mice were measured to evaluated the anti-fatigue effect of AED.Result The yield rate of the lyophilized AED was （9.41%±0.82%）.The total polysaccharides，polyphenol and flavonoid in AED were （33.40%±0.88%），（30.80%±2.28%） and （24.62%±0.86%） differently.There was no difference among the groups about body weight and organ index（P>0.05）.AED could prolong the exhaustive swimming time，lower the content of BLA and BUN，increase serum LDH activity（P<0.01）.Compare to the control group，hepatic and muscle glycogen，hepatic SOD activity of the mice in the three dose groups after exercise increased，while hepatic MDA content decreased（P<0.01）.Conclusion AED could increase endurance capacity of physical exhaustion and had anti-fatigue activity.

Keywords：walnut;Diaphragma juglandis Fructus;queous extract;mice;anti-fatigue