CNV-seq結(jié)合STR多態(tài)性分析在檢測(cè)孕早期流產(chǎn)物中潛在葡萄胎病例的應(yīng)用價(jià)值

郭芳芳?彭海山?萬(wàn)志彬?李怡?楊潔霞

【摘要】目的 評(píng)估基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序（CNV-seq）結(jié)合短串聯(lián)重復(fù)序列（STR） 多態(tài)性分析技術(shù)在檢測(cè)孕早期（≤9周）流產(chǎn)物組織中潛在葡萄胎病例的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集行流產(chǎn)物組織CNV-seq結(jié)合STR多態(tài)性檢測(cè)的孕早期病例，挑取部分新鮮絨毛組織進(jìn)行CNV-seq結(jié)合STR多態(tài)性檢測(cè)，其余組織常規(guī)固定后進(jìn)行病理組織學(xué)檢測(cè)。結(jié)果 共納入782例孕早期病例，經(jīng)CNV-seq結(jié)合STR多態(tài)性檢測(cè)共檢出66例（8.44%）潛在葡萄胎病例，其中57例（7.29%）為三倍體，9例（1.15%）為全基因組同源單親二倍體。57例三倍體中有52例隨訪到病理形態(tài)學(xué)結(jié)果，其中19例提示為宮腔內(nèi)絨毛，12例為部分絨毛間質(zhì)水腫，12例為偶見(jiàn)絨毛、極少許絨毛和少許絨毛，9例未見(jiàn)絨毛。病理形態(tài)學(xué)提示未見(jiàn)絨毛和少許絨毛的3例三倍體病例的STR基因分型檢測(cè)示染色體異常三倍體2例、部分性葡萄胎1例。9例全基因組同源單親二倍體中，經(jīng)病理形態(tài)學(xué)及p57Kip2蛋白免疫組織化學(xué)染色提示為完全性葡萄胎8例，余1例病理形態(tài)學(xué)提示少許絨毛，隨后經(jīng)STR基因分型檢測(cè)證實(shí)該病例也為完全性葡萄胎。結(jié)論 CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)孕早期流產(chǎn)物對(duì)發(fā)現(xiàn)潛在的葡萄胎病例有一定的價(jià)值，特別是完全性葡萄胎;相較于病理組織學(xué)檢測(cè)，STR基因分型檢測(cè)在孕早期葡萄胎標(biāo)本中更易獲得可靠的結(jié)果。

【關(guān)鍵詞】孕早期;葡萄胎;短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性分析;產(chǎn)前診斷;基因分型

CNV-seq combined with STR polymorphism in detection of potential hydatidiform mole in abortion tissues of early pregnancy women Guo Fangfang， Peng Haishan， Wan Zhibin， Li Yi， Yang Jiexia. Medical Genetics Center， Guangdong Women and Children Hospital， Guangzhou 510010， China Corresponding author， Yang Jiexia， E-mail： yjxfimmu@ 126. com

【Abstract】Objective To evaluate the value of CNV-seq combined with short tandem repeat （STR） polymorphism in the detection of potential hydatidiform mole in abortion tissues of early pregnancy women （≤ 9 weeks）. Methods Clinical data of early pregnancy women whose abortion tissues were subjected to CNV-seq combined with STR polymorphism analysis were collected. The villi tissues were partially prepared for CNV-seq combined with STR detection， and the remaining tissues were routinely fixed for histopathological diagnosis. Results A total of 782 early pregnancy women were recruited. Among them， potential hydatidiform mole was detected in 66 cases （8.44%） by CNV-seq combined with STR including 57 cases of triploid （7.29%） and nine cases of whole genome isodisomy （1.15%）. Pathomorphological results were obtained in 52 of the 57 triploid cases. Normal villi were observed in 19 patients. Partial villi stromal edema was seen in 12 cases. Villi were occasionally noted or a slight or extremely slight amount of villi could be found in 12 cases. No villis were seen in nine cases. Pathomorphological examination prompted that among three triploid cases with no villi and a slight amount of villi receiving STR genotyping， two patients were diagnosed with chromosomal abnormal triploid and one case of partial hydatidiform mole. Among nine cases of whole genome isodisomy， eight patients were indicated as complete hydatidiform mole by pathomorphological diagnosis and p57Kip2 immunohistochemistry， and the remaining one patient with a slight amount of villi was subsequently confirmed as complete hydatidiform mole by STR genotyping. Conclusions The combination of CNV-seq and STR has certain value in the detection of potential hydatidiform mole in the abortion tissues of women with early pregnancy， especially for complete hydatidiform mole. Compared with pathomorphological diagnosis， STR genotyping is more likely to obtain reliable results in detecting potential hydatidiform mole in early pregnancy women.

【Key words】Early pregnancy;Hydatidiform mole;Short tandem repeat polymorphism;Prenatal diagnosis;Genotyping

葡萄胎主要包括完全性葡萄胎和部分性葡萄胎，幾乎所有的完全性葡萄胎為完全父源性單親二倍體，部分性葡萄胎是具有雙雄單雌來(lái)源的三倍體[1]。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多的孕早期流產(chǎn)妊娠物被發(fā)現(xiàn)為葡萄胎。但是，孕早期葡萄胎往往沒(méi)有典型的臨床癥狀，超聲對(duì)孕早期葡萄胎的總體檢出率也僅為50%左右[2]。2018年我國(guó)發(fā)布的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病診斷與治療指南（第四版）中，明確了病理組織學(xué)檢測(cè)是葡萄胎最重要和最終的診斷方法[3]。但是孕早期葡萄胎病理組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)可能不典型，水腫性流產(chǎn)與葡萄胎病理組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)差異可能會(huì)不明顯，且病理學(xué)家對(duì)此的解讀也存在一定的主觀性[4]。因此，對(duì)孕早期流產(chǎn)妊娠中葡萄胎的精準(zhǔn)診斷仍然存在挑戰(zhàn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)基于下一代測(cè)序技術(shù)的基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序（CNV-seq）臨床應(yīng)用的相關(guān)探索表明，CNV-seq結(jié)合短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）多態(tài)性分析技術(shù)可應(yīng)用于流產(chǎn)物樣本分析，以檢測(cè)覆蓋全染色體非整倍體、大片段缺失/重復(fù)及全基因組CNV，與此同時(shí)還可以發(fā)現(xiàn)三倍體及同源單親二倍體[5]。為此，本研究回顧性分析了經(jīng)CNV-seq結(jié)合STR多態(tài)性檢測(cè)在孕早期（≤9周）流產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的潛在的66例葡萄胎病例，希望為此類病例的臨床管理提供一定的依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

收集2019年1月至2020年1月在廣東省婦幼保健院進(jìn)行流產(chǎn)物CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)的孕早期（≤9周）782例病例基本資料及其流產(chǎn)物組織（自然流產(chǎn)排出或稽留流產(chǎn)清宮術(shù)取出）。從新鮮流產(chǎn)物中挑取少量絨毛組織用于CNV-seq及STR檢測(cè)，剩余標(biāo)本常規(guī)固定后用于病理組織學(xué)檢測(cè)。所收集病例基本資料包括年齡、孕周、超聲檢查結(jié)果等。本研究已通過(guò)廣東省婦幼保健院倫理委員會(huì)審批，檢測(cè)前患者均已簽署知情同意書。

二、病理組織學(xué)檢查

將流產(chǎn)物組織置入適量的4%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋并制作HE切片，由2位病理醫(yī)師對(duì)HE 切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，判斷是否有絨毛水腫并記錄其程度，具體指標(biāo)包括絨毛積液水腫程度、是否有絨毛水池形成（大小超過(guò)絨毛的50%）、是否有細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生及其增生程度等[6]。對(duì)所有的經(jīng)CNV-seq及STR檢測(cè)提示為同源單親二倍體的標(biāo)本進(jìn)行p57Kip2蛋白免疫組織化學(xué)染色（免疫組化），采用廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司的p57Kip2鼠抗人單克隆抗體行鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）染色檢測(cè)p57Kip2蛋白在絨毛和蛻模組織中的表達(dá)情況，若絨毛間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)葉細(xì)胞無(wú)棕色或者棕黃色染色，結(jié)果判定為陰性，即完全性葡萄胎，見(jiàn)圖1。

三、STR檢測(cè)

1. STR多態(tài)性檢測(cè)流程

提取流產(chǎn)物組織及其母體外周血DNA，具體操作流程參照Magen磁珠法通用核酸提取試劑盒說(shuō)明書。NanoDrop 2000評(píng)估所提取 DNA的濃度和純度。將DNA濃度稀釋至20 ～ 40 ng/μl，利用熒光標(biāo)記多重PCR技術(shù)擴(kuò)增13個(gè)常染色體STR位點(diǎn)（21號(hào)染色體5個(gè)、18和13號(hào)染色體各4個(gè)）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ABI 3500 xL測(cè)序儀毛細(xì)管電泳檢測(cè)出各基因座的等位基因電泳數(shù)據(jù)，將電泳數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)分析軟件GeneMarker V2.2.0，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判斷。根據(jù)GeneMarker V2.2.0軟件分析結(jié)果，計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)峰面積比值得出染色體倍體正?；虍惓５慕Y(jié)論（二倍體、同源單親二倍體、三倍體）。

2. STR葡萄胎基因分型檢測(cè)流程

將經(jīng)STR多態(tài)性檢測(cè)為同源單親二倍體及三倍體的流產(chǎn)物病例，進(jìn)一步與母體外周血DNA STR位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，分析其親代來(lái)源，從而鑒定出完全性葡萄胎（單雄來(lái)源單親二倍體）及部分性葡萄胎（雙雄來(lái)源三倍體），見(jiàn)圖2。

四、CNV-seq檢測(cè)

取流產(chǎn)物組織DNA 100 ng進(jìn)行片段化處理，具體操作流程參照試劑盒NEBNext dsDNA Fragmentase Kit說(shuō)明書進(jìn)行。按照晶芯? 胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)片段化后的DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建及定量，然后上機(jī)測(cè)序。測(cè)序完成后，將樣本的DNA序列與已知人類參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用環(huán)狀二元分割算法分析樣本的CNV情況。通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)及查閱文獻(xiàn)，參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)指南，對(duì)這些變異進(jìn)行五分類（致病性、可能致病、臨床意義不明確、可能良性、良性），判斷樣本是否存在全基因組致病性及可能致病性拷貝數(shù)變異[7]。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

連續(xù)型變量如符合正態(tài)分布以表示，否則以中位數(shù)（最小值 ～ 最大值）表示;分類資料以例（%）或例（相對(duì)比）表示。

結(jié)果

一、一般資料

2019年1月至2020年1月在廣東省婦幼保健院進(jìn)行流產(chǎn)物CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)的孕早期（≤9周）病例共782例，其中潛在的葡萄胎妊娠共66例（8.44%），包括57例（7.29%）三倍體和9例（1.15%）同源單親二倍體。57例三倍體病例妊娠年齡為30 （24 ～ 41）歲，檢測(cè)時(shí)孕周為6 （5 ～ 9）周。9例同源單親二倍體妊娠年齡為28（24 ～ 31）歲，檢測(cè)時(shí)孕周為6（6 ～ 7）周。

二、57例三倍體病例分析

1. 總體情況

57例三倍體中，以69，XXY最常見(jiàn)（25例，43.85%），69，XXX次之（20例，35.09%），69，XYY 最少見(jiàn)（2例，3.51%），其余病例包括1例亞三倍體、8例超三倍體以及1例三倍體合并染色體部分三體和部分單體，即69，XXY， 3p12.1-pter（dup）， 3q11.2-qter（del）， 13q21.1-qter（del）。其中52例隨訪到病理組織形態(tài)學(xué)結(jié)果，提示為宮內(nèi)絨毛及蛻膜組織19例、提示為部分絨毛間質(zhì)水腫12例，提示為偶見(jiàn)絨毛、極少許絨毛和少許絨毛12例，未見(jiàn)絨毛9例。

2. 未見(jiàn)絨毛和少許絨毛的三倍體病例分析

3例病理形態(tài)學(xué)結(jié)果提示未見(jiàn)絨毛和少許絨毛的三倍體病例，經(jīng)與母體外周血DNA STR位點(diǎn)比對(duì)（即STR基因分型檢測(cè)），發(fā)現(xiàn)2例為染色體異常三倍體（雙雌單雄來(lái)源三倍體），1例為部分性葡萄胎（雙雄單雌來(lái)源三倍體），見(jiàn)表1及圖3A ～ C。

3. 全基因組同源單親二倍體病例分析

9例全基因組同源單親二倍體均隨訪到病理組織學(xué)結(jié)果，其中8例提示為完全性水泡狀胎塊，且7例進(jìn)一步p57Kip2蛋白免疫組化結(jié)果均為陰性，提示此8例均為完全性葡萄胎病例;其余1例提示宮腔內(nèi)少許絨毛及蛻膜組織（病例4），但經(jīng)母體外周血與流產(chǎn)物組織DNA STR位點(diǎn)比對(duì)，證實(shí)該病例流產(chǎn)物組織為完全父源單親二倍體，見(jiàn)圖3D。結(jié)合該病例超聲結(jié)果為妊娠（胚芽長(zhǎng)3 mm，未見(jiàn)胎心搏動(dòng)）合并混合回聲區(qū)，提示該標(biāo)本可能為妊娠合并完全性葡萄胎。9例完全性葡萄胎病例中有3例（3/9）呈現(xiàn)完全性葡萄胎的典型超聲表現(xiàn)（蜂窩狀回聲和密集光點(diǎn)波動(dòng)）。

討論

葡萄胎具有進(jìn)展為持續(xù)性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的危險(xiǎn)性，且完全性葡萄胎的進(jìn)展率（15% ～ 20%）比部分性葡萄胎（0.5% ～ 4.0%）更高[8]。因此精確區(qū)分完全性和部分性葡萄胎以及非葡萄胎流產(chǎn)對(duì)指導(dǎo)后續(xù)合理的臨床管理具有重要的臨床意義。

在孕早期依靠單純的病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)難以準(zhǔn)確區(qū)分完全性葡萄胎、部分性葡萄胎以及非葡萄胎流產(chǎn)，因此常常需要進(jìn)一步輔以p57Kip2蛋白免疫組化分析。其中完全性葡萄胎p57Kip2蛋白免疫組織化學(xué)染色陰性，部分性葡萄胎和非葡萄胎流產(chǎn)p57Kip2蛋白免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性。因此，病理組織形態(tài)學(xué)結(jié)合p57Kip2蛋白免疫組織化學(xué)染色基本可以較好地將完全性葡萄胎鑒別出來(lái)，但是卻無(wú)法區(qū)分部分性葡萄胎和其他非葡萄胎流產(chǎn)[9]。目前研究顯示，葡萄胎的遺傳學(xué)病因是存在過(guò)剩的父源性基因組，STR基因分型技術(shù)通過(guò)將母體組織與流產(chǎn)物組織DNA進(jìn)行STR位點(diǎn)比對(duì)，分析流產(chǎn)物DNA的親代來(lái)源，可以檢測(cè)出完全性葡萄胎（完全單雄來(lái)源單親二倍體）及部分性葡萄胎（雙雄單雌來(lái)源三倍體），從而對(duì)完全性葡萄胎及部分性葡萄胎做出精確診斷并明確分型[9-10]。

本研究中經(jīng)CNV-seq結(jié)合STR多態(tài)性檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)9例同源單親二倍體，其中7例同源單親二倍體經(jīng)病理形態(tài)學(xué)和進(jìn)一步免疫組織化學(xué)檢測(cè)驗(yàn)證為完全性葡萄胎。1例病理形態(tài)學(xué)提示為水泡狀胎塊，患者未選擇進(jìn)一步免疫組化檢測(cè)。這提示在STR位點(diǎn)足夠多的情況下，經(jīng)CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的同源單親二倍體是完全性葡萄胎的可能性較大，建議進(jìn)一步對(duì)這部分病例抽取母體外周血進(jìn)行STR分型檢測(cè)，以明確是否為完全性葡萄胎。其余1例同源單親二倍體比較特殊，其病理組織學(xué)檢測(cè)提示宮腔內(nèi)少許絨毛及部分蛻膜組織，但經(jīng)母體外周血與流產(chǎn)物組織 STR位點(diǎn)比對(duì)，證實(shí)該病例流產(chǎn)物組織為父源單親二倍體，結(jié)合該病例超聲結(jié)果為妊娠合并混合回聲區(qū)，提示該標(biāo)本應(yīng)該是妊娠合并完全性葡萄胎。如果排除病理學(xué)觀察者主觀因素導(dǎo)致的誤差，推測(cè)可能是由于標(biāo)本取材問(wèn)題導(dǎo)致的病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果與STR基因分型檢測(cè)結(jié)果不一致，即經(jīng)CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)的標(biāo)本組織取自于完全性葡萄胎組織，而經(jīng)病理檢測(cè)的標(biāo)本取自于正常妊娠組織。因此，對(duì)于懷疑雙胎之一合并葡萄胎的病例取材時(shí)需特別注意，精確分離不同來(lái)源的妊娠物成分并分別進(jìn)行檢測(cè)對(duì)于保證準(zhǔn)確的結(jié)果是至關(guān)重要的。Liu等[11]的研究也認(rèn)為對(duì)于難以分離的混合妊娠物標(biāo)本建議采用病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)篩查、免疫組化分析和STR基因分型相結(jié)合的方法，對(duì)可能合并葡萄胎的雙胎妊娠的混合妊娠產(chǎn)物組進(jìn)行診斷。

本研究中，共有4例病理組織學(xué)提示未見(jiàn)絨毛（2例）和少許絨毛（2例）的病例進(jìn)行了進(jìn)一步的STR基因分型檢測(cè)（即將絨毛組織STR位點(diǎn)與母體組織STR位點(diǎn)比對(duì)），結(jié)果顯示其中1例為部分性葡萄胎、1例為完全性葡萄胎。因此，相比較于病理組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)，STR基因分型檢測(cè)僅需極少的標(biāo)本量，且結(jié)果判斷不受主觀因素影響，在孕早期可獲得的絨毛數(shù)量較少的情況下更易獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。

本研究中確診的9例完全性葡萄胎和1例部分性葡萄胎的超聲結(jié)果均提示未見(jiàn)卵黃囊，僅見(jiàn)混合回聲團(tuán)，其中9例完全性葡萄胎病例中僅3例呈現(xiàn)完全性葡萄胎的典型超聲表現(xiàn)（蜂窩狀回聲和密集光點(diǎn)波動(dòng)）。既往研究者發(fā)現(xiàn)在孕早期（≤12周）葡萄胎中，超聲檢查對(duì)早期葡萄胎的檢出率約為50%，其中對(duì)完全性葡萄胎和部分性葡萄胎的檢出率分別約為70%和20%[2]。本研究收集到的完全性葡萄胎標(biāo)本量較少，且孕周更早（≤9周），所以超聲檢查對(duì)早期葡萄胎的檢出率更低，僅為3/9。但是以往的研究結(jié)果及本研究的結(jié)果均提示，超聲對(duì)早期葡萄胎的檢出率有限，應(yīng)重視孕早期非活胎妊娠物的送檢，通過(guò)STR 基因分型檢測(cè)有利于對(duì)可疑葡萄胎病例進(jìn)行精確診斷并明確分型，減少葡萄胎的漏診。

本研究的不足之處在于，大部分經(jīng)CNV-seq及STR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的潛在的葡萄胎病例（三倍體及同源單親二倍體）沒(méi)有經(jīng)過(guò)STR基因分型檢測(cè)驗(yàn)證，日后我們將對(duì)這部分病例進(jìn)行及時(shí)的臨床反饋并建議進(jìn)一步的精確診斷明確葡萄胎分型。

綜上所述，CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)孕早期流產(chǎn)物對(duì)發(fā)現(xiàn)潛在的葡萄胎病例有一定的價(jià)值，特別是完全性葡萄胎;相較于病理組織學(xué)檢測(cè)，CNV-seq及STR檢測(cè)僅需要極少的標(biāo)本量，且不受主觀因素判斷影響，當(dāng)結(jié)合母體DNA 進(jìn)行STR基因分型檢測(cè)時(shí)，在孕早期（≤9周）葡萄胎標(biāo)本檢測(cè)中更易獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果。建議對(duì)經(jīng)CNV-seq及STR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的潛在葡萄胎病例進(jìn)行及時(shí)隨訪及進(jìn)一步的精確診斷并明確分型，為此類病例后續(xù)合理的臨床監(jiān)測(cè)及預(yù)后管理提供依據(jù)。

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（收稿日期：2021-01-22）

（本文編輯：林燕薇）