大葉金頂杜鵑繁育系統(tǒng)研究

余海清,帥偉,姜欣華,劉燕云,廖成云,姬慧娟,馬文寶*

1.甘孜藏族自治州林業(yè)科學研究所，四川康定 626001；

2.四川省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院四川成都 610081；

3.四川省林業(yè)科學研究院，森林和濕地生態(tài)恢復與保育四川重點實驗室，四川成都 610081

繁育系統(tǒng)是植物研究中較受關(guān)注的領(lǐng)域之一，植物的花部綜合特征、花部各性器官、花開放式樣、自交親和程度及交配系統(tǒng)等都與其繁育系統(tǒng)密切相關(guān)[1]。植物繁育過程中與傳粉者及傳粉行為一起決定了植物后代的遺傳組成和適合度[2]，是種群有性生殖的紐帶[3,4]。植物繁育系統(tǒng)已成為一個以“生殖”為核心，以探討物種多樣性發(fā)生歷史、維持機理和保護策略為最終目的的綜合交叉研究[5]。

杜鵑花是世界四大園林花卉之一，被稱為“木本花卉之王”，中國杜鵑屬植物有576種，川西南地區(qū)是杜鵑屬的現(xiàn)代分布中心與多度中心之一[6]。杜鵑花屬被認為是適應(yīng)輻射的一個大屬，在我國西南山地尤其是橫斷山區(qū)域特有種比例非常高，為探討生態(tài)成種提供了一個很好的研究系統(tǒng)[7]。目前，國內(nèi)外研究學者對不同亞屬不同亞組的杜鵑花物種開展了繁育系統(tǒng)研究，如常綠杜鵑花亞屬中云錦杜鵑花亞組的云錦杜鵑花[8]和大白杜鵑花[9]、長序杜鵑花亞組的R. ponticum[10,11]和R.aureum[12]、樹形杜鵑花亞組的樹形杜鵑R.arboreum[13]和露珠杜鵑花亞組馬雄杜鵑花[14]；杜鵑花亞屬三花杜鵑亞組的繡葉杜鵑[15]、多鱗杜鵑[16]、有鱗大花組的大喇叭杜鵑花[17]和高山杜鵑組R. ferrugineum[18]；異蕊杜鵑花亞屬R.semibarbatum[19]；羊躑躅亞屬R.canadense[20]等4個亞屬7亞組（組）的杜鵑花物種的繁育系統(tǒng)進行了研究，但是對于常綠杜鵑花亞屬大理杜鵑花亞組植物以及在野外條件下原生種，特別是橫斷山區(qū)域特有杜鵑花物種的繁殖生物學方面研究相對較少[9,14,15,16]。

大葉金頂杜鵑R. prattii（康定杜鵑花）為常綠杜鵑花亞屬Subg.Hymenanthes大理杜鵑花亞組Subsect.Taliensia的灌木或小喬木，中國特有種，產(chǎn)于四川西部、西南部和西北部[21]，生于亞高山暗針葉林林緣、灌叢，分布海拔2800～4000 m，在葉形和花部形狀等與金頂杜鵑區(qū)別明顯，耿玉英已恢復其為種等級[6]，大葉金頂杜鵑具有花朵大、花色艷麗、植株大型、群落優(yōu)勢明顯等特點，是優(yōu)良的雜交親本種質(zhì)資源。本研究以四川省甘孜州瀘定縣貢嘎山自然保護區(qū)內(nèi)自然分布的大葉金頂杜鵑為研究對象，觀察開花物候、花部綜合特征和昆蟲訪花行為，統(tǒng)計了雜交指數(shù)、花粉-胚珠比，進行了人工控制授粉試驗，為豐富常綠杜鵑花亞屬大理杜鵑花亞組植物繁育系統(tǒng)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和四川省特有野生杜鵑花資源開發(fā)利用及新品種選育提供理論依據(jù)。

1 研究地點

研究地點位于四川省甘孜藏族自治州貢嘎山自然保護區(qū)雅家埂雅家情海附近，N29°51'57"，E102°2'16"，海拔3820 m。該區(qū)地處中國東部亞熱帶濕潤季風區(qū)與青藏高原寒冷氣候的過渡帶，多年平均氣溫3.8℃，最冷月（1月）和最熱月（7月）平均溫度分別為?4.3℃和11.9℃，年平均降水量1940 mm，年平均蒸發(fā)量1578.6 mm，年平均空氣相對濕度90.2%，土壤為山地暗棕壤，土層厚度40～80 cm，含沙量高、滲透性強，呈弱酸性。

該地區(qū)植被以寒溫帶灌叢為主，其生活型組成以小喬木和中小灌木為主，伴生種類主要為各種杜鵑花屬植物，包括無柄杜鵑（R.watsonii）、隴蜀杜鵑（R. przewalskii）、櫟葉杜鵑（R. phaeochrysum）、山光杜鵑（R.oreodoxa）、問客杜鵑（R.ambiguum）和毛蕊杜鵑（R.websterianum）等，其他木本和草本植物有峨眉冷杉（Abies fabri）、川滇高山櫟（Quercus aquifolioides）、西康花楸（Sorbus prattii）和全緣葉綠絨蒿（Meconopsisintegrifolia）等。

2 試驗方法

2.1 花部綜合特征及開花動態(tài)觀察

2019～2020年連續(xù)兩年對野外居群的大葉金頂杜鵑R. prattii進行了群體花期觀察；隨機選取30株生長健壯、樹形高大的大葉金頂杜鵑植株標記為研究樣株，對個體和花序的花期觀察，并記錄相對應(yīng)的開花時間。

隨機標記花蕾期300朵，花開放后，每天取下20朵，每天對單花開花動態(tài)進行觀測，記錄花冠顏色、花粉散粉、花氣味、花粉活力、柱頭可授性、花冠長、花管長、內(nèi)徑、花開口寬、花絲長、花柱長、柱頭和花藥的相對位置。

2.2 大葉金頂杜鵑的花粉活力和柱頭可授性

每天從采下20朵花中隨機選3朵用來測定單花的花粉活力和柱頭可授性。

2.2.1 花粉活力

花粉活力采用TCC法測定[22]。將花粉置于小型離心管中用TCC染液進行染色，置于40℃的恒溫水中放置15～30 min后，將其染液置于載玻片上，在光學顯微鏡下觀察?；ǚ郾蝗境杉t色（活力較強）和淡紅色（活力較弱）為有活力花粉，無色則為無活力的花粉。

花粉活力=（紅色花粉數(shù)+淡紅色花粉數(shù)）/觀察花粉總數(shù)×100%。

2.2.2 柱頭可授性

采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法[23]檢測柱頭可授性。隨機標記發(fā)育階段一致的花，開花后每隔1 d取10朵花的花柱，在凹面載玻片中加入體積比為1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22的反應(yīng)液，將柱頭浸入其中，觀察柱頭周圍是否呈現(xiàn)藍色并產(chǎn)生大量氣泡，根據(jù)氣泡的數(shù)量確定其柱頭可授性的強弱。

2.3 大葉金頂杜鵑的繁育系統(tǒng)

大葉金頂杜鵑的繁育系統(tǒng)依據(jù)Cruden標準[24]、Dafni標準[23]和套袋試驗結(jié)果進行綜合判定。

2.3.1 花粉量及花粉-胚珠數(shù)(P/O)的測定

隨機取將開放的花朵的花藥5個置于干凈的玻璃瓶中，在花藥開裂后，加入15%的葡萄糖溶液2 mL，充分搖勻后，取10μL于顯微鏡下數(shù)出花粉粒數(shù)N，即可得每朵花的花粉量=200×N，同時取子房在體視顯微鏡下剖開，統(tǒng)計胚珠數(shù)，即可得P/O。以上重復測定10次[25]。

2.3.2 雜交指數(shù)估算

按照Dafni的標準進行花朵大小及開花行為的測量及繁育系統(tǒng)的評判。具體方法是：①花朵直徑6 mm記為3。②花藥開裂時間與柱頭可授期之間的時間間隔，同時或雌蕊先熟記為0；雄蕊先熟記為l。③柱頭與花藥的空間位置，同一高度記為0；空間分離記為1。三者之和為OCI值。

2.3.3 套袋試驗

對大葉金頂杜鵑植株分別進行套袋實驗，A.不套袋、不去雄：自由傳粉，用于檢測自然條件下的傳粉情況；B.不去雄套袋：自發(fā)的自花傳粉，檢測是否存在自花授粉；C.去雄授同株異花：開花前去雄，同株異花之間人工傳粉，檢測自交是否親和；D.去雄授異株異花：人工異株異花傳粉，用不同植株的花粉進行異花授粉后用牛皮紙?zhí)状?，檢測雜交是否親和；E.不套袋 去雄：自然條件下的異花傳粉，自由傳粉；F.套袋 去雄:開花前用牛皮紙?zhí)状?、去雄、不授粉，檢測無融合生殖。

花期結(jié)束后，統(tǒng)計每個處理的坐果率。坐果率（%）=結(jié)實數(shù)/處理的花數(shù)×100%。

2.4 大葉金頂杜鵑的訪花昆蟲特性

對大葉金頂杜鵑種群的訪花昆蟲進行調(diào)查，隨機標記已開放的花朵40朵，從9∶00—17∶00進行連續(xù)3 d的觀察，記錄其訪花昆蟲種類、訪花行為和活動頻率。

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有測量數(shù)據(jù)均用Excel 2007進行統(tǒng)計分析，測量結(jié)果均用平均值±標準差表示；使用SPSS 22.0軟件對花冠長、花管長、內(nèi)徑、花開口寬等花部形態(tài)特征和坐果率等進行單因素方差分析。

4 試驗結(jié)果

4.1 開花物候

大葉金頂杜鵑群體5月初始花至6月中下旬結(jié)束，花期持續(xù)48～55 d左右，單株花期18～32 d，花序水平花期13～16 d，單花開花持續(xù)時間為10～11 d。

4.2 花部特征及開花動態(tài)

大葉金頂杜鵑為傘形總狀花序，花6～10朵，花冠鐘形，粉紅色，內(nèi)面基部有深紅色斑點，裂片5，花絲10～12，花藥黑色，橢圓形孔裂式散粉，雌蕊1枚，雌蕊比花冠略短，高于雄蕊，柱頭小，黃綠色（見圖1）。

根據(jù)大葉金頂杜鵑單花開花周期、花部特征動態(tài)和開花動態(tài)，將單花開放進程分為花蕾期、初花期、盛花期和凋謝期4個時期（見圖1和表1）?；ɡ倨谥恋蛑x期花瓣顏色由粉紅色逐漸變淡至白色；花蕾期花粉便開始線性散粉，柱頭彎曲具有少量黏液，初花期和盛花期花藥大量線性散粉，柱頭直立分泌大量黏液，凋謝期花藥散粉和柱頭分泌黏液逐漸減少；花蕾期時開始分泌花蜜，隨著開花進程蜜量逐漸較少，整個過程無氣味（見表1）。

圖1 大葉金頂杜鵑開花周期Fig.1 Flowering stageof Rhododendron prattii

表1 大葉金頂杜鵑單花的開花動態(tài)Tab.1 Flowering dynamicsof singleflower of R. prattii

隨著大葉金頂杜鵑蕾膨大開花，其花柱、花絲、子房均持續(xù)生長，花蕾期與初花期、盛花期和凋謝期的最短花絲和最長花絲表現(xiàn)出顯著差異；不同時期間花柱長無差異；柱頭始終位于花藥群上方，花藥和柱頭空間最短距離下降趨勢明顯，花蕾期和凋謝期的花藥和柱頭空間最短距離呈現(xiàn)出顯著差異，子房長顯著增長（見表2）。

4.3 花粉活力和柱頭可授性

大葉金頂杜鵑花粉活力在自然條件下持續(xù)時間為10 d左右。大葉金頂杜鵑蕾期花粉活力為58%，初花期花粉活力維持在60%左右；盛花期花粉活力最高，達95%以上；隨后緩慢下降，至凋謝期（第8 d）花粉活力仍保持58%，第9 d快速下降，至第10 d時花粉活力仍還有15%（見圖2），與花部動態(tài)中花粉散粉情況保持一致（見表2）。

表2 大葉金頂杜鵑的花部綜合特征動態(tài)變化Tab.2 Dynamic changesof flower comprehensive characteristicsof R. prattii

大葉金頂杜鵑在花蕾期花柱頭周圍便有氣泡出現(xiàn)，可授性相對較弱；盛花期和凋謝期（第7 d和第8 d）柱頭周圍呈現(xiàn)藍色并產(chǎn)生大量氣泡，可授性最強；凋謝期第9 d開始柱頭萎蔫，但仍具有可授性（見圖2）。

圖2 大葉金頂杜鵑粉活力和柱頭可授性日變化Fig.2 Diurnal variation of pollen activity and stigma receptivity of R. prattii

4.4 繁育系統(tǒng)

4.4.1 花粉量及花粉-胚珠數(shù)(P/O)

根據(jù)Cruden的標準，大葉金頂杜鵑繁育系統(tǒng)屬于兼性異交（見表3），意味著異交程度不斷上升。

表3 大葉金頂杜鵑的花粉-胚珠比（平均值±標準差）Tab.3 Pollen-ovuleratio estimate of R. prattii (Mean ± S.D.)

4.4.2 雜交指數(shù)

大葉金頂杜鵑雜交指數(shù)表明（見表4），其雜交指數(shù)（OCI）為4，故其繁育系統(tǒng)為異交，部分自交親和，需要傳粉者。

表4 大葉金頂杜鵑雜交指數(shù)觀測結(jié)果Tab.4 Hybridization index of R. prattii

4.4.3 套袋試驗

從大葉金頂杜鵑植株套袋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人工異株異花傳粉坐果率為97.5%，說明大葉金頂杜鵑異交率最高，與其他套袋實驗坐果率呈現(xiàn)出顯著差異；在自然條件下的傳粉其坐果率為71.5%，自然條件下異株異花和同株異花的坐果率為54.7%；不去雄自花花粉授粉主動自交坐果率為23.1%，授同株異花花粉其坐果率為55.5%，自然狀態(tài)下、同株異花和自然條件下異株異花和同株異花的坐果率不存在顯著差異，但與自花授粉的坐果率相比差異顯著，說明大葉金頂杜鵑異交，自交親和，需要傳粉者；大葉金頂杜鵑不存在無融合生殖現(xiàn)象（見圖3）。

4.5 昆蟲訪花特性

大葉金頂杜鵑的訪花媒介主要為雙翅目食蚜蠅類（成蟲）和蠅類（成蟲）、膜翅目的葉峰類（成蟲），蛛形綱（蜘蛛）、象甲類（成蟲）等。整個花期過程中，花蕾期和凋謝期昆蟲數(shù)量相對較少，盛花期是訪花昆蟲的活動高峰時期。觀察中發(fā)現(xiàn)雙翅目的食蚜蠅類（成蟲）和蠅類（成蟲）在中午11:00—13:00其訪花頻率最高，有效傳粉昆蟲主要以食蚜蠅類（成蟲）為主，蠅類主要針對凋謝期的花朵進行傳粉，與柱頭不發(fā)生有效接觸，不是有效的傳粉昆蟲。

鞘翅目象甲類的訪花行為表現(xiàn)為在大葉金頂杜鵑的花蕾上打洞，進入蜜腺部位，從基部開始啃食花絲、花柱，導致花敗育。葉蜂類會在大葉金頂杜鵑中停留，但未觀察到其攜帶花粉。蜘蛛類常在大葉金頂杜鵑中爬行或在花叢中織網(wǎng)，未見其覓食花蜜或花粉（見圖4）。

5 結(jié)論與討論

在繁育系統(tǒng)的演化中，與之相適應(yīng)的重要特點是花部特征及花生物學特性的協(xié)調(diào)進化[8]。大葉金頂杜鵑具有異交（蟲媒傳粉）花部綜合特征，花大、色彩艷麗，能夠吸引昆蟲為其進行傳粉，食蚜蠅類（成蟲）是其的有效傳粉昆蟲。大葉金頂杜鵑的雌、雄蕊具有明顯的空間異位，在4個時期中柱頭始終處于雄蕊上方（見表1），是典型的雌雄異位植物，這種空間布置可避免自花授粉，是植物避免自交的一種機制[26]。

但與此同時，由于其分布海拔較高，天氣變化無常導致其缺乏足夠有效的傳粉昆蟲（見圖4），其也具備了自交的花部綜合特征。大葉金頂杜鵑單花期長10～12 d，其在花蕾期和開花后8 d內(nèi)均保持較高活力（58%以上），說明了該物種雄性適合度較高，生殖持續(xù)能力較強。與此同時，其柱頭從花蕾期就有少量分泌黏液，從盛花期第4 d到凋謝期期第8 d柱頭具有較強可授性，二者成熟時間同步性高（見圖2），為其自交提供了有利條件。

根據(jù)花粉-胚珠比（見表3）、雜交指數(shù)（見表4）、傳粉昆蟲觀察（見圖4）以及套袋實驗結(jié)果（見圖3）來看，其異株異花傳粉坐果率達到97.5%，顯著高于其他套袋結(jié)果，與繡葉杜鵑的同株異花的坐果率（36.3%）[15]相比，大葉金頂杜鵑花同株異花和自花授粉的坐果率分別為55.5%和23.1%，表現(xiàn)出異交，并具有較高自交親和性。同時，大葉金頂杜鵑的盛花期花藥孔裂散出線狀的花粉，凋謝期花冠翻卷并呈下垂狀，從基部與花托分開，花瓣（連同雄蕊）從子房前移到花柱，使原來略為上翹的花柱與柱頭下垂，部分花粉粘附到柱頭上，借助花瓣脫落實現(xiàn)花后授粉（自花授粉），可能是對傳粉媒介短缺的一種適應(yīng)，是其對惡劣生境的一種繁殖保障機制。這個結(jié)果也和同為常綠杜鵑花亞屬的R. ponticum[10,11]、R.aureum[12]，R.arboreum[13]以及杜鵑花亞屬的繡葉杜鵑花[15]、馬雄杜鵑花[14]的研究結(jié)果一致。因此，我們認為大葉金頂杜鵑花的繁育系統(tǒng)是異交，自交親和，需傳粉者。

圖3 大葉金頂杜鵑坐果率統(tǒng)計結(jié)果Fig.3 Statistical resultsof seed setting rateof R. prattii

圖4 傳粉媒介對大葉金頂杜鵑的訪花行為Fig.4 Flower visiting behavior of pollination media to R. prattii

盡管植物的自交在占據(jù)新生境，克服高山傳粉媒介匱乏，增強植物種群的局部適應(yīng)性，獲得父母本優(yōu)良性狀等方面具有一定的優(yōu)勢，但R.aureum由于在末花期自交率增加，其坐果率下降，種子產(chǎn)量減少，種子敗育率增大[12]。云錦杜鵑長期自交引起近交衰退，導致后代適應(yīng)性下降，云錦杜鵑種群的明顯衰退現(xiàn)象[8]。我們也發(fā)現(xiàn)大葉金頂杜鵑種群有明顯衰退現(xiàn)象，是否在凋謝期的補充自交造成了其種子適合度下降還有待于進一步研究。同時，大葉金頂杜鵑異株異交套袋結(jié)果高達97.5%，為杜鵑花雜交育種工作提供了良好杜鵑花的母本，項目組通過與低海拔分布的大白杜鵑等進行雜交育種，已獲得部分雜交種幼苗，可為低海拔地區(qū)的杜鵑花新品種創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。