川產(chǎn)黃精組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

姜麗瓊,李文俊,肖前剛,陳文靈,徐志萍,浣杰,楊洪燕,楊敏,宋若楠

成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川成都 611130

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科黃精屬藥食同源植物，根莖含有黃精多糖、黃酮及皂甙等多種對(duì)人體有益的化學(xué)物質(zhì)和活性物質(zhì)，具有益腎、潤(rùn)肺、健脾、補(bǔ)氣的功效[1]，

在醫(yī)療、保健、食品等方面的應(yīng)用具有良好的前景[2,3]。黃精種苗繁育以種子繁殖與塊莖繁殖為主，種子存在著生理休眠現(xiàn)象，種胚存在生理后熟，人工催苗步驟復(fù)雜、成本大[4,5]，塊莖繁殖消耗大量的藥材資源，繁殖系數(shù)低，長(zhǎng)期使用該塊莖繁殖會(huì)導(dǎo)致種性退化、病蟲(chóng)害加劇等問(wèn)題[6]，采用有性繁殖方式和常規(guī)無(wú)性繁殖手段無(wú)法滿足生產(chǎn)需要，以致其資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求[7]，優(yōu)質(zhì)種苗的匱乏仍是制約四川黃精產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的一個(gè)瓶頸[8]。組織培養(yǎng)快繁技術(shù)較傳統(tǒng)繁殖方式，具有節(jié)約成本，不受空間時(shí)間制約，繁殖系數(shù)高，保留親本優(yōu)良性狀等優(yōu)勢(shì)。目前，有些黃精品種的組培快繁技術(shù)研究已經(jīng)取得成功并應(yīng)用在生產(chǎn)上[9-15]，但四川的黃精品種還沒(méi)有見(jiàn)過(guò)報(bào)道。四川黃精不回苗、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)，適合四川大量發(fā)展。本研究基于本土優(yōu)良黃精，在誘導(dǎo)、增殖、生根階段探究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比以及基本培養(yǎng)基對(duì)組培快繁體系的影響，助力黃精中藥材資源的合理開(kāi)發(fā)和保護(hù)利用，中藥材種植生產(chǎn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化的GAP研究，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化及中藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采自成都市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)研究所科研中藥材種質(zhì)資源圃中的無(wú)病蟲(chóng)害、生長(zhǎng)健壯、品質(zhì)優(yōu)良的黃精單株，3—5月晴天采集黃精帶芽塊莖作為供試材料。

2 試驗(yàn)方法

2.1 外植體預(yù)處理

黃精帶芽塊莖先用流水中沖洗30 min后，75%乙醇溶液表面消毒1 min，無(wú)菌水沖洗1次，然后用0.1%HgCl2溶液分別浸泡10 min、12 min、15 min、18 min與20 min，無(wú)菌水沖洗5次，無(wú)菌紙吸干水分，然后將塊莖表皮、切口與滅菌劑有接觸的部位輕輕削去，接種在MS（6-BA 0.2 mg·L?1、NAA 0.2 mg·L?1）培養(yǎng)基中。每3 d觀察一次，及時(shí)清理污染的培養(yǎng)瓶，30 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

將預(yù)處理完成的外植體接種MS培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基分別設(shè)置激素水平6-BA和NAA分別為(1.0 mg·L?1、2.0 mg·L?1、5.0 mg·L?1)，NAA(0.01 mg·L-1、0.05 mg·L?1、0.1 mg·L?1、0.2 mg·L?1)共12個(gè)激素處理，每個(gè)處理30瓶，60 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)情況。培養(yǎng)溫度25℃±2℃，光照強(qiáng)度1500～2 000 lx，光照時(shí)間14 h·d?1。

2.3 基本培養(yǎng)基篩選

根據(jù)材料在培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)培養(yǎng)表現(xiàn)情況，對(duì)基本培養(yǎng)基做一些篩選（1/2MS、MS、改良MS、3/2改良MS、1/2改良MS），選擇最佳基本培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基接種30瓶，60d后觀測(cè)生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)溫度25℃±2℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)間14 h·d?1。（MS:Murashige and Skoog培養(yǎng)基；MS改良培養(yǎng)基：在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，KNO3上調(diào)150%，NH4NO3下調(diào)150%；1/2MS，3/2MS為培養(yǎng)基成分調(diào)節(jié)比例，即大量元素比例，其余含量不變）。

2.4 壯苗培養(yǎng)基的篩選

后期的培養(yǎng)過(guò)程中，將長(zhǎng)勢(shì)健壯且生長(zhǎng)情況基本一致的小苗接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)并對(duì)6-BA和NAA做出適當(dāng)調(diào)整并添加不同的物質(zhì)，6-BA(0.5 mg·L?1、1.0 mg·L?1)，NAA(0.05 mg·L?1、0.1 mg·L?1、0.2 mg·L?1)6個(gè)激素處理組合，增加基本培養(yǎng)基1/3(Mg2++Fe3+)、1/2KH2PO4含量，每個(gè)處理接種10瓶，45 d后觀察增殖情況，培養(yǎng)溫度25℃±2℃，光照強(qiáng)度1500～2 000 lx，光照時(shí)間14 h·d?1。

2.5 生根培養(yǎng)基的篩選

壯苗培養(yǎng)后，選擇長(zhǎng)勢(shì)較好的健壯材料進(jìn)行生根培養(yǎng)，以MS作為基本培養(yǎng)基并添加AC 0.5 g·L?1，分別設(shè)置激素水平6-BA（0 mg·L?1、0.02 mg·L?1、0.05 mg·L?1、0.1 mg·L?1），NAA（0.2 mg·L?1、0.5 mg·L?1、1.0 mg·L?1）12個(gè)激素處理組合，每個(gè)處理接種10瓶，30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況，培養(yǎng)溫度25℃±2℃，光照強(qiáng)度1500～2 000 lx，光照時(shí)間14 h·d?1。

2.6 煉苗移栽

將瓶苗從生根培養(yǎng)室移至具有遮陽(yáng)條件的自然光環(huán)境下，逐漸打開(kāi)瓶蓋，擺放7 d后，取出，洗凈根部培養(yǎng)基，用0.1%多菌靈浸泡根部15 min后栽植與腐殖土、珍珠巖、椰糠、河沙為原料混合基質(zhì)中；移栽后用75%的遮陽(yáng)網(wǎng)覆蓋，栽植后第7 d、15 d及30 d，交替噴施0.1%多菌靈、甲基托布津或百菌清，60 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃精外植體預(yù)處理

在材料清洗上，要徹底清洗一些褶皺，污染大多為真菌污染，由表1可知，外植體消毒處理隨處理時(shí)間增加污染率與存活率明顯下降，在15 min時(shí)，污染率低存活率高，滿足黃精的外植體消毒，達(dá)到兩者之間的一個(gè)平衡。與孫駿威[16]等人研究相比，污染率與剔除污染瓶苗后存活率相近，消毒時(shí)間更短，避免消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)外植造成的影響。

表1 外植體不同處理時(shí)間的比較Tab.1 Comparison of different treatment timeof explants

3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

由表2可知，隨著6-BA濃度升高，黃精組培苗生長(zhǎng)勢(shì)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，培養(yǎng)基中的6-BA濃度為5.0 mg·L?1時(shí)生長(zhǎng)勢(shì)最佳，超過(guò)該濃度生長(zhǎng)勢(shì)受到抑制。發(fā)芽率，生長(zhǎng)勢(shì)隨著NAA濃度上升呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，超過(guò)0.1 mg·L?1，葉色受到影響，最佳濃度為0.1 mg·L?1，發(fā)芽率高、生長(zhǎng)勢(shì)好、芽易抽長(zhǎng)、葉色綠、苗壯、底部有根萌發(fā)。綜上所述，以MS+6-BA 5.0 mg·L?1+ NAA0.1 mg·L?1為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基激素配比的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)萌芽生長(zhǎng)情況表Tab.2 the germination and growth of MS medium with different medium hormoneratio

3.3 基本培養(yǎng)基篩選

根據(jù)材料生長(zhǎng)情況，對(duì)基本培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在6-BA 5.0 mg·L?1+NAA 0.1 mg·L?1激素水平下，MS培養(yǎng)基表現(xiàn)最佳，改良MS培養(yǎng)基較好，1/2MS培養(yǎng)基表現(xiàn)一般，1/2改良MS、3/2改良MS培養(yǎng)基表現(xiàn)較差（見(jiàn)表3）。

表3 不同基本培養(yǎng)基下生長(zhǎng)情況表Tab.3 growth of different basic media

3.4 壯苗培養(yǎng)基篩選

如表4所示，在黃精壯苗培養(yǎng)基的篩選上，隨著NAA濃度增加，存在葉變大卷曲現(xiàn)象。6-BA濃度為0.5 mg·L?1時(shí)效果最佳，添加1 g·L?1AC有利于葉片舒展，減少褐化現(xiàn)象，增加基本培養(yǎng)基Mg2++Fe3+，1/2KH2PO4利于克服葉片發(fā)黃現(xiàn)象，并促進(jìn)壯苗增殖效果。綜上所述，最佳壯苗培養(yǎng)基配方為MS+6-BA0.5 mg·L?1+ NAA0.05 mg·L?1+1/3(Mg2++Fe3+)↑+ 1/2KH2PO4↑+1g·L?1AC。

表4 不同激素配比增殖表現(xiàn)情況表Tab.4 proliferation performance of different hormone ratio

3.5 生根培養(yǎng)基的篩選

由表5可知，黃精生根培養(yǎng)基激素配比上，NAA激素濃度為1 mg·L?1時(shí)效果最佳，添加蔗糖與赤霉素的培養(yǎng)基表現(xiàn)效果不佳。6-BA在激素水平上0～0.05 mg·L?1之間效果都比較好，其中以0.05 mg·L?1時(shí)效果最佳；培養(yǎng)基添加AC 0.5 g·L?1以防止褐變和有害物質(zhì)的積累，同時(shí)創(chuàng)造的黑暗環(huán)境利于根的誘導(dǎo)和根系的生長(zhǎng)。綜上所述，最佳生根培養(yǎng)基為MS +6-BA0.05 mg·L?1+ NAA1.0 mg·L?1+AC0.5 g·L?1。

表5 不同激素配比生根表現(xiàn)情況表Tab.5 rooting performance of different hormone ratio

3.6 煉苗移栽

將生根的和未生根的材料進(jìn)行室外移栽，30 d統(tǒng)計(jì)成活率，成活率95%以上。

4 結(jié)論與討論

以四川本土優(yōu)良黃精塊莖或新萌發(fā)葉柄作為繁殖材料，建立四川本土黃精組培技術(shù)體系，外植體最佳預(yù)處理方式為75%乙醇溶液表面消毒1 min，然后用0.1%HgCl2溶液浸泡15 min，達(dá)到存活率與污染率平衡最佳。

在組培過(guò)程中，需要外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控，NAA促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根，與細(xì)胞分裂素6-BA相互促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)[17,18]，過(guò)高的濃度干擾正常的蛋白質(zhì)和核酸代謝過(guò)程，產(chǎn)生抑制作用。生長(zhǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)素的種類與濃度以及比例，對(duì)于植物組織培養(yǎng)有著極其重要的作用。通過(guò)梯度試驗(yàn)，得出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基方案MS+6-BA 5.0 mg·L?1+NAA 0.1 mg·L?1；最佳增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.5 mg·L?1+NAA0.05 mg·L?1+1/3(Mg2++Fe3+)↑+1/2KH2PO4↑+AC 1g·L?1；最佳生根培養(yǎng)基MS +6-BA0.05 mg·L?1+NAA 1.0 mg·L?1+AC 0.5 g·L?1，生根率可達(dá)到85%以上，通過(guò)煉苗移栽，移植存活率95%以上。黃精無(wú)菌體系的建立，為黃精產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗奠定基礎(chǔ)。

圖1 黃精組培育苗圖Fig.1 cultivation seedlingsof Polygonatum