神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合牙髓干細(xì)胞可促進(jìn)大鼠種植體周圍骨結(jié)合

路曉淼，田瑞雪，劉姍姍，徐錦程

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，安徽 蚌埠233004

口腔種植是臨床常用的治療手段，種植體的成功植入依賴于種植體周圍骨結(jié)合的形成。在骨結(jié)合形成的過(guò)程中，成骨細(xì)胞發(fā)揮至關(guān)重要的作用，由其介導(dǎo)的骨形成能夠促進(jìn)種植體周圍的骨組織發(fā)生重建［1,2］。但是，受到牙周組織健康狀況、種植體植入手術(shù)創(chuàng)傷等因素的影響，種植體植入后骨結(jié)合的形成耗時(shí)較長(zhǎng)，也有部分患者無(wú)法形成良好的骨結(jié)合，最終對(duì)種植體植入的治療效果產(chǎn)生不利影響［3,4］。

近些年，組織工程技術(shù)被用于多種牙周疾病的輔助治療，牙髓干細(xì)胞（DPSCs）是從恒牙中分離得到的具有高度增殖活性及分化潛能的一類干細(xì)胞，在一定誘導(dǎo)條件下可以向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化。已有研究報(bào)道，DPSCs可用于修復(fù)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體、減輕牙周炎的牙周組織破壞、促進(jìn)種植體周圍骨結(jié)合的形成［5-8］，但上述修復(fù)效果受到DPSCs向成骨分化能力的影響，需要聯(lián)合使用合適的干預(yù)手段以促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）是參與神經(jīng)發(fā)育、再生的細(xì)胞因子，也在骨代謝、成骨分化中起促進(jìn)作用［9,10］。近年來(lái)有學(xué)者證實(shí)了神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合多種干細(xì)胞共同作用促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖［11］，但是未對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究。我們課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，NGF能促進(jìn)兔DPSCS體外增殖、成骨分化［12］，但是兩者聯(lián)合作用于種植體骨結(jié)合界面的研究未見(jiàn)報(bào)道.因此，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合使用NGF與DPSCs來(lái)調(diào)控種植體周圍骨結(jié)合，具體分析了聯(lián)合干預(yù)措施促進(jìn)骨結(jié)合的作用及機(jī)制，以期更好地幫助加快種植體成骨，指導(dǎo)臨床。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司、生產(chǎn)許可SCXK（滬）2017-0012。

1.1.2 藥品及試劑 NGF、K252a、β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松、茜素紅（Sigma），CD44、CD29、CD45、CD34 抗體（BD），HE 染色試劑盒（上海歌凡生物），RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（上海貝博生物科技公司），OCN、RUNX2抗體（Abcam）。

1.1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），流式細(xì)胞儀（BD），顯微鏡（Nikon），micro-CT儀（Skyscan），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad）。

1.2 方法

1.2.1 DPSCs的分離及鑒定 處死大鼠并游離下頜骨，在含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中浸泡，分離切牙牙髓組織并充分剪碎，放入3 g/LⅠ型膠原酶消化液中、37 ℃消化90 min，1000 r/min離心15 min后棄去上清、保留沉淀，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸、接種在培養(yǎng)皿中，每3 d更換1次培養(yǎng)基，待貼壁細(xì)胞融合至80%后用0.25%胰蛋白酶消化并按照1∶3的比例傳代，取部分第3 代DPSCs 細(xì)胞進(jìn)行鑒定，孵育CD44、CD29、CD45、CD34 的抗體后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)表達(dá)量。

1.2.2 DPSCs的分組及給藥 第4代DPSCs接種在培養(yǎng)板內(nèi)，分為對(duì)照組、NGF組、NGF+K252a組，給藥方法如下：對(duì)照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理，NGF組用含有100 μg/L NGF 的培養(yǎng)基處理，NGF+K252a 組用含有100 μg/L NGF及100 μg/L K252a的培養(yǎng)基處理。每個(gè)處理調(diào)節(jié)設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 DPSCs的成骨誘導(dǎo)分化及茜素紅染色 第4 代DPSCs 調(diào)節(jié)密度至1×107/L，接種在6 孔板內(nèi)、每孔3 mL，24 h以后細(xì)胞貼壁并棄去培養(yǎng)基。按照1.2.2的分組給藥，用0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10%胎牛血清的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基配置藥物，1次、3 d更換培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3周后進(jìn)行茜素紅染色，在顯微鏡下觀察染色情況并對(duì)鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 動(dòng)物分組、造模及給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、DPSCs 組、DPSCs+NGF 組、DPSCs+K252a 組、DPSCs+NGF+K252a組，每組各8只，均按照下列方法建立股骨種植模型：腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg，麻醉后在右后肢股骨外側(cè)做切口，鈍性分離肌肉層、股骨干中段，用骨鉆做2 mm×4 mm種植體窩，將1枚種植體稍稍加壓放入種植體窩，逐層拉攏縫合切口。DPSCs組、DPSCs+NGF組、DPSCs+K252a組、DPSCs+NGF+K252a組，在放入種植體前，在局部注射密度為1×109/mL的DPSCs 懸液1 mL，對(duì)照組注射不含細(xì)胞的培養(yǎng)基1 mL；術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始，DPSCs+NGF 組給予2.0 U/kg NGF腹腔注射，DPSCs+K252a組給予100 μg/kg K252a腹腔注射，DPSCs+NGF+K252a組給予2.0 U/kg NGF腹腔注射及100 μg/kg K252a腹腔注射，均為1次/d，連續(xù)4周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過(guò)倫理審查，批號(hào)為[2020]第193號(hào)。

1.2.5 種植體周圍骨組織micro-CT掃描 大鼠股骨縱軸與micro-CT檢查床的移動(dòng)軸平行，掃描分辨率47 μm、掃描時(shí)間14 min，圍繞骨痂上下各取50個(gè)層面，得到圖像后計(jì)算骨礦密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）。

1.2.6 種植體周圍骨組織HE染色 取出種植體、保留種植體周圍骨組織，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋、制作病理切片，采用HE染色試劑盒對(duì)切片進(jìn)行染色，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，顯微鏡下觀察骨小梁結(jié)構(gòu)、新骨組織形態(tài)、骨基質(zhì)排列，拍照記錄。

1.2.7 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測(cè) 取分組給藥的DPSCs 及分組干預(yù)后的大鼠種植體周圍骨組織，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞、提取蛋白，測(cè)定蛋白含量后將30 μg 蛋白樣本加入SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，1∶1000 稀釋的RUNX2、OCN 一抗4 ℃孵育PVDF 過(guò)夜；次日，洗PVDF 膜3 遍后室溫孵育1∶2000 稀釋的二抗1 h，再次洗PVDF膜3遍，在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，根據(jù)灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析、進(jìn)一步比較采用SNK-q檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPSCs表面干細(xì)胞標(biāo)志物的檢測(cè)

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，DPSCs 表面干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD29的陽(yáng)性率均在95%以上，造血系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45、CD34陰性表達(dá)（圖1）。

圖1 DPSCs表面CD44、CD29、CD45、CD34表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Fig.1 Flow cytometric detection of stem cell surface biomarkers CD44,CD29,CD45 and CD34 on DPSCs.

2.2 NGF促進(jìn)DPSCs成骨分化

與對(duì)照組比較，NGF組DPSCs成骨誘導(dǎo)分化后的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增加（P=0.0025），Runx2的表達(dá)水平均明顯增加（P=0.002）、OCN的表達(dá)水平均明顯增加（P<0.001）；與NGF組比較，NGF+K252a組DPSCs成骨誘導(dǎo)分化后的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少（P=0.0253），Runx2的表達(dá)水平均明顯減少（P=0.003）、OCN的表達(dá)水平均明顯減少（P=0.0012，圖2、圖3、表1）。

表1 3組DPSCs鈣結(jié)節(jié)數(shù)量及Runx2、OCN表達(dá)水平的比較Tab.1 Number of calcium nodules and expression levels of Runx2 and OCN in the DPSCs in the 3 groups(n=4)

圖2 3組DPSCs成骨誘導(dǎo)分化的茜素紅染色Fig.2 Alizarin red staining of DPSCs in the 3 groups after osteogenic differentiation (Original magnification:×200).

圖3 3組DPSCs中Runx2、OCN的蛋白條帶Fig.3 Protein expression levels of Runx2 and OCN in DPSCs in the 3 groups.

2.3 NGF聯(lián)合DPSCs對(duì)大鼠種植體周圍骨組織micro-CT的影響

與對(duì)照組比較，DPSCs 組種植體周圍骨組織的BMD明顯增加（P=0.0046）、Tb.Th明顯增加（P=0.0396）、Tb.N 均明顯增加（P=0.024）；DPSCs+NGF 組種植體周圍骨組織的BMD 高于DPSCs 組（P=0.0138）、Tb.Th 高于DPSCs 組（P=0.0246）、Tb.N 高于DPSCs 組（P=0.0351）；DPSCs+K252a 組種植體周圍骨組織的BMD 與DPSCs 組無(wú)顯著差異（P=0.314）、Tb.Th 與DPSCs組無(wú)顯著差異（P=0.175）、Tb.N與DPSCs組無(wú)顯著差異（P=0.269）；與DPSCs+NGF 組比較，DPSCs+NGF+K252a 組種植體周圍骨組織的BMD 明顯減少（P=0.0299）、Tb.Th明顯減少（P=0.029）、Tb.N均明顯減少（P=0.0186，表2，圖4）。

表2 5組大鼠種植體周圍骨組織micro-CT參數(shù)的比較Tab.2 Micro-CT scanning results of the bone tissues surrounding the implants in the 5 groups(n=8)

圖4 5組大鼠種植體周圍骨組織micro-CT的圖像Fig.4 Micro-CT scanning of bone tissues surrounding the implants in the 5 groups of rats.

2.4 NGF聯(lián)合DPSCs對(duì)種植體周圍骨組織HE染色的影響

對(duì)照組種植體周圍骨組織中骨小梁稀少、纖維骨痂排列散亂；DPSCs組及DPSCs+K252a組植體周圍骨組織中骨小梁較多、骨基質(zhì)排列緊湊；DPSCs+NGF組骨小梁進(jìn)一步增多、骨基質(zhì)排列致密且有完整的纖維骨痂形成；DPSCs+NGF+K252a組植體周圍骨組織中的骨小梁、骨基質(zhì)較DPSCs+NGF組減少（圖5）。

圖5 5組大鼠種植體周圍骨組織的HE染色Fig.5 HE staining of the bone tissues surrounding the implants in the 5 groups.

2.5 NGF 聯(lián)合DPSCs 對(duì)種植體周圍骨組織中Runx2、OCN表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，DPSCs 組種植體周圍骨組織中Runx2的表達(dá)水平均明顯增加（P=0.003）、OCN的表達(dá)水平明顯增加（P=0.0259），DPSCs+NGF組種植體周圍骨組織中Runx2 的表達(dá)水平高于DPSCs 組（P=0.0057）、OCN的表達(dá)水平高于DPSCs組（P=0.0166）；DPSCs+K252a組種植體周圍骨組織中Runx2的表達(dá)水平與DPSCs組無(wú)顯著差異（P=0.061）、OCN的表達(dá)水平與DPSCs組無(wú)顯著差異（P=0.321）；與DPSCs+NGF組比較，DPSCs+NGF+K252a 組種植體周圍骨組織中Runx2的表達(dá)水平明顯減少（P=0.0003）、OCN 的表達(dá)水平明顯減少（P=0.003，圖6，表3）。

表3 5組大鼠種植體周圍骨組織中Runx2、OCN表達(dá)水平的比較Tab.3 Runx2 and OCN levels in the bone tissue around the implants in the 5 groups(n=8)

圖6 5組大鼠種植體周圍骨組織中Runx2、OCN的蛋白條帶Fig.6 Runx2 and OCN expression levels in the bone tissues surrounding the implants in the 5 groups detected by Western blotting.

3 討論

口腔種植治療過(guò)程中，種植體植入后局部骨組織重建耗時(shí)較長(zhǎng)、部分患者骨組織重建不良，對(duì)種植治療的效果產(chǎn)生不利影響［13,14］。NGF是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)骨代謝調(diào)控的細(xì)胞因子［15］。TrkA是NGF的高親和力受體，NGF的多種生物學(xué)作用均由TrkA介導(dǎo)［16-21］。本實(shí)驗(yàn)首先探索NGF對(duì)DPSCs成骨分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后DPSCs中的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增加，DPSCs中成骨標(biāo)志基因RUNX2及OCN的表達(dá)水平也明顯增加，這提示NGF能夠促進(jìn)DPSCs的成骨分化。為了驗(yàn)證NGF是否通過(guò)TrkA促進(jìn)DPSCs的成骨分化，TrkA的拮抗劑K252a被用于實(shí)驗(yàn)，在NGF干預(yù)的同時(shí)將K252a后，成骨誘導(dǎo)分化的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目及RUNX2、OCN的表達(dá)水平均減少，表明TrkA拮抗劑K252a逆轉(zhuǎn)了NGF促進(jìn)DPSCs成骨分化的作用，進(jìn)而提示NGF通過(guò)TrkA促進(jìn)DPSCs的成骨分化。

DPSCs 促進(jìn)種植體周圍骨缺損修復(fù)、種植體周圍骨結(jié)合的作用已經(jīng)被多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)［22,23］，也有研究報(bào)道在DPSCs 移植的同時(shí)外源性使用一氧化氮、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠增強(qiáng)DPSCs修復(fù)種植體周圍骨缺損、促進(jìn)種植體周圍骨結(jié)合的作用［24-26］。然而DPSCs聯(lián)合NGF作用于種植體周圍的研究未多見(jiàn)，本研究的離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)NGF能夠通過(guò)TrkA促進(jìn)DPSCs成骨分化，在此基礎(chǔ)上將NGF聯(lián)合DPSCs 用于種植體大鼠模型，在建立股骨種植模型中單用DPSCs 或聯(lián)用DPSCs 及NGF，經(jīng)micro-CT 檢查種植體周圍骨組織的重建情況可知，單用DPSCs 或聯(lián)用DPSCs 及NGF 均能增加BMD、Tb.Th、Tb.N，單用DPSCs 增加種植體周圍骨組織骨密度的結(jié)果與既往其他研究報(bào)道DPSCs 促進(jìn)種植體周圍骨結(jié)合的結(jié)果一致；在DPSCs 的基礎(chǔ)上聯(lián)用NGF 能夠較單用DPSCs 更有效的增加BMD、Tb.Th、Tb.N，表明NGF 能夠增強(qiáng)DPSCs 促進(jìn)種植體周圍骨結(jié)合的作用，與NGF 在離體細(xì)胞中促進(jìn)DPSCs 成骨分化的作用吻合。

DPSCs移植在種植體周圍能夠通過(guò)自身的成骨分化能力向成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而在種植體周圍形成骨結(jié)合，進(jìn)而逐步實(shí)現(xiàn)種植體周圍骨組織的改建［27-30］。在本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，股骨種植模型大鼠接受DPSCs移植后，在骨組織切片中觀察到種植體周圍形成小梁狀新骨、間質(zhì)內(nèi)膠原纖維束狀排列，成骨標(biāo)志基因RUNX2、OCN的表達(dá)增多，表明DPSCs向成骨細(xì)胞分化、增強(qiáng)了種植體周圍骨結(jié)合；在DPSCs移植的同時(shí)使用NGF，種植體周圍小梁狀新骨的形成及間質(zhì)內(nèi)膠原纖維均增多，成骨標(biāo)志基因RUNX2、OCN的表達(dá)也進(jìn)一步上調(diào)，表明NGF能夠增強(qiáng)DPSCs的成骨分化，與micro-CT觀察到骨密度增加的結(jié)果吻合。在NGF聯(lián)合DPSCs干預(yù)的同時(shí)，加用TrkA的拮抗劑K252a后，NGF聯(lián)合DPSCs增加骨密度、上調(diào)RUNX2及OCN表達(dá)的作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表明NGF聯(lián)合DPSCs促進(jìn)種植體周圍骨結(jié)合的作用與TrkA有關(guān)。

綜上所述，NGF 聯(lián)合DPSCs 能夠促進(jìn)大鼠種植體周圍骨結(jié)合，增加骨密度、上調(diào)成骨標(biāo)志基因表達(dá)，NGF通過(guò)TrkA促進(jìn)DPSCs成骨分化是NGF聯(lián)合DPSCs 發(fā)揮上述作用的可能分子機(jī)制。通過(guò)此研究，可以驗(yàn)證NGF 結(jié)合DPSCs 對(duì)種植體周圍早期成骨的促進(jìn)作用，為構(gòu)建組織工程化種植體提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期縮短種植體骨結(jié)合修復(fù)的時(shí)間，更好地服務(wù)臨床。