濁點(diǎn)萃取響應(yīng)面優(yōu)化山楂總黃酮提取工藝

孟慶華,張光輝

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) ,陜西 咸陽(yáng) 712046)

山楂為薔薇科植物山里紅、山楂或野山楂的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于山東、河北、河南、遼寧、江蘇[1]?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，山楂中含山楂酸、黃酮類、內(nèi)酯、糖類、甙類、蛋白質(zhì)及鈣、磷、鐵等人體必需元素[2～3]。山楂具有消食健胃，行氣散瘀之功效[4]。山楂黃酮提取目前多為醇提法，郭艷華[5]等考察了浸提時(shí)間、溫度、料液比、酸度等對(duì)提取山楂中總黃酮含量的影響；王珊珊[6]等通過(guò)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面模型設(shè)計(jì)分析不同乙醇濃度、提取溫度、超聲時(shí)間和料液比對(duì)山楂總黃酮提取率的影響；劉煊崴[7]等采用索式提取法，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)考察了甲醇濃度、提取時(shí)間以及料液比對(duì)提取效果的影響。濁點(diǎn)萃取是利用濁點(diǎn)原理與表面活性劑的增溶作用對(duì)待分離組分進(jìn)行富集的一種新型的液-液萃取技術(shù)，李凱龍[10]等通過(guò)濁點(diǎn)富集萃取方法對(duì)蔬菜中天然維生素K、同系物葉綠醌(PK)和四烯甲萘醌(MK-4)，并通過(guò)液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)；陳邈[11]等通過(guò)濁點(diǎn)萃取-高效液相色譜法對(duì)化妝品中4種合成酚類抗氧化劑進(jìn)行了檢測(cè)。藥用山楂主要有炒山楂、焦山楂、山楂炭和生山楂幾種，炮制方法不同，功效有所差異。本項(xiàng)目采用濁點(diǎn)萃取法，考察山楂炮制方法對(duì)山楂黃酮含量的影響。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV1780紫外分光光度計(jì)(日本島津)；Avanti JXN-30/26高效離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾公司)；超聲波清洗機(jī)XC-400(濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司)；恒溫水浴鍋(上海一凱儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品(批號(hào)100800-201506，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；化學(xué)試劑(AR，南京化學(xué)試劑股份有限公司)；山楂藥材購(gòu)于陜西西安地區(qū)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室王繼濤老師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 濁點(diǎn)萃取山楂中總黃酮

將山楂烘干去籽粉碎，過(guò)60目篩，精密稱取山楂粉20.0 g置于燒杯，向其中加入200 mL聚氧乙烯脂肪醇醚(Genapol-X80)，攪拌均勻，400 W超聲30 min后，800轉(zhuǎn)離心5 min，取上清液加NaCl溶液適量混均勻，60 ℃水浴30 min，800轉(zhuǎn)離心10 min至溶液清晰分為兩層，分液漏斗分離去下層水相，上層有機(jī)層中加入20 mL乙醇降低黏度，用超濾膜過(guò)濾，回收聚氧乙烯脂肪醇醚，濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，得山楂黃酮提取物。

2.2 山楂黃酮含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取0.0100 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加無(wú)水乙醇溶解定容至100 mL，配制成濃度為0.10 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6個(gè)10 mL容量瓶分別編號(hào)，精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL分別注入1～6號(hào)容量瓶，再分別加入0.30 mL 5%亞硝酸鈉、0.30 mL 10%硝酸鋁，搖勻靜置5 min充分反應(yīng)后，滴加2.00 mL 4%氫氧化鈉[16]，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以1號(hào)為空白，于507 nm處測(cè)定吸光度(A)[17]。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制回歸曲線，回歸方程為A=9.277C+0.0026，r=0.9986，證明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在0.01～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.2.2 山楂黃酮含量測(cè)定 精密稱取山楂提取物0.1000 g，加無(wú)水乙醇溶解定容至100 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾待測(cè)。準(zhǔn)確移取濾液2.00 mL，按照2.2.1方法顯色，得供試品溶液，在507 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，依據(jù)回歸方程計(jì)算黃酮含量。

2.2.3 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn): 取同一蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，于507 nm處測(cè)定吸光度，平行6次，結(jié)果平均吸光度為0.264，RSD為0.47%( n =6)，說(shuō)明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn): 取一份供試品溶液，于507 nm處測(cè)定吸光度，然后放置2、4、6、8、10 h分別測(cè)定吸光度，平均值0.374，RSD為0.83%(n=6)，說(shuō)明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取山楂提取物0.1000 g 5份，按照2.2.2方法處理并測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮含量，黃酮平均含量26.13 mg·g-1，RSD為1.02%(n=5)，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

回收率試驗(yàn): 取已知含量山楂提取物，加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，按照供試品溶液制備方法制備測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果回收率平均值為100.2%，RSD為1.02%(n=5)，說(shuō)明該方法回收率良好。

2.3 山楂黃酮提取工藝優(yōu)化

山楂黃酮提取采用濁點(diǎn)萃取法，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選，考察液固比(A)、萃取時(shí)間(B)、鹽溶液離子強(qiáng)度(C)、聚氧乙烯脂肪醇醚濃度(D)對(duì)提取率的影響，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)4因素3水平表，見(jiàn)表1。利用Design expert 8.0軟件試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。以山楂黃酮提取率為響應(yīng)值，使用Design expert 8.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 濁點(diǎn)萃取4因素3水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸分析的結(jié)果

由響應(yīng)面分析可知，回歸方程為：Y=2.62+0.27A+0.18B+0.0.18C+0.073D+0.0657AB+0.045AC-0.055AD-0.028BC+0.058CD-0.28A2-0.23B2-0.16C2-0.13D2?；貧w模型P=0.0001<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，四個(gè)因素對(duì)山楂黃酮提取率影響大小為：考察液固比>萃取時(shí)間>鹽溶液離子強(qiáng)度>聚氧乙烯脂肪醇醚濃度，AB交互效應(yīng)最顯著,BC交互最弱。

圖2 液固比與萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖3 液固比與萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖4 液固比與萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖5 液固比與萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖6 液固比與萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

通過(guò)Design expert 8.0的處理，得到各因素對(duì)提取率的響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖1～6所示。預(yù)測(cè)山楂黃酮的最佳提取工藝為：液料比 87.32∶1，萃取時(shí)間30.68 min，鹽溶液離子強(qiáng)度3.45 mol·L-1、聚氧乙烯脂肪醇醚濃度34.2 g·L-1，提取率為2.72%。

2.4 最佳工藝驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面軟件Design expert8.0預(yù)測(cè)的最佳提取工藝，為了便于實(shí)際實(shí)驗(yàn)，將預(yù)測(cè)工藝修正為液料比 90∶1、萃取時(shí)間30 min、鹽溶液離子強(qiáng)度3.50 mol·L-1、聚氧乙烯脂肪醇醚濃度35 g·L-1進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果山楂黃酮提取率為2.66%，與預(yù)測(cè)值2.72%接近。

2.5 不同炮制方法對(duì)山楂黃酮含量影響

取炒山楂、焦山楂、山楂炭和生山楂烘干去籽粉碎，按照2.1和2.2方法處理計(jì)算黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同炮制山楂黃酮含量比較

3 討論

濁點(diǎn)萃取是利用濁點(diǎn)原理和表面活性劑的增溶作用對(duì)待分離組分進(jìn)行富集的一種新型萃取技術(shù)，利用表面活性劑在水相中形成膠束可以增加待分離組分溶解度，繼而改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)引發(fā)相分離，達(dá)到對(duì)待測(cè)組分分離的目的。筆者實(shí)驗(yàn)通過(guò)濁點(diǎn)萃取法提取山楂黃酮，通過(guò)響應(yīng)面軟件Design expert8.0優(yōu)化，提取工藝最終提取率達(dá)為2.66%，并且發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度或者改變表面活性劑濃度等均可以提高提取率。濁點(diǎn)萃取法由于不使用有機(jī)溶劑，具有綠色環(huán)保，成本低廉的特點(diǎn)，有可能成為未來(lái)中藥有效成分提取的綠色新工藝。