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    金花小檗種子總黃酮的優(yōu)化提取及抗氧化活性

    2021-10-14 07:20:14尚志福鄭友琪張濟(jì)顯位竹君張北方張瑩
    特產(chǎn)研究 2021年5期
    關(guān)鍵詞:液固比金花小檗

    尚志福,鄭友琪,張濟(jì)顯,位竹君,張北方,張瑩

    (東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院,黑龍江 哈爾濱150040)

    金花小檗(Berberis wilsonae Hemsl.)為小檗科(Berberidaceae)小檗屬植物,產(chǎn)于我國(guó)云南、四川、貴州、西藏和陜西。金花小檗根枝入藥可代黃連用,具有清熱、解毒和消炎的功效,用于止痢、赤眼紅腫等,也可用為飲料資源[1,2],小檗屬植物三顆針為我國(guó)藥典收錄藥材[3]。研究表明,小檗屬植物含多種小檗堿類、酚酸類、黃酮類和有機(jī)酸類化合物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗驚厥、降血壓、改善記憶和抑菌等多種藥理作用[4-8]。黃酮類化合物作為重要植物的次生代謝物,具有抗氧化等多種生物活性,在飲料等食品加工領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景[9-11]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)小檗屬植物的研究主要集中于根莖中的小檗堿類成分,對(duì)其他部位的研究相對(duì)較少,其中吳莉莉等[12]對(duì)產(chǎn)自黑龍江伊春的細(xì)葉小檗葉進(jìn)行了總黃酮測(cè)定,65%乙醇提取物的總黃酮含量可達(dá)0.513%;李金輝等[13]對(duì)采自貴州六盤水的威寧小檗根、莖、葉進(jìn)行了黃酮類化合物的含量測(cè)定和抗氧化活性研究,結(jié)果表明威寧小檗葉中的黃酮含量高達(dá)126.22 mg/g,且抗氧化活性最好;買爾旦·玉蘇甫等[14]對(duì)購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)的喀什小檗果實(shí)研究表明,喀什小檗果實(shí)水提物具有非內(nèi)皮依賴性的舒張血管作用。金花小檗果實(shí)因相關(guān)研究開展較少使其應(yīng)用受到限制。目前,小檗屬植物種子的研究多集中于發(fā)芽及幼苗更新[15-17],關(guān)于金花小檗種子的化學(xué)和藥理學(xué)研究亦未見報(bào)道。本研究以乙醇為提取溶劑,應(yīng)用超聲輔助技術(shù)提取金花小檗種子中的總黃酮,在考察功率、體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度和超聲時(shí)間等單因素對(duì)總黃酮提取得率影響的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面(RSM)設(shè)計(jì)進(jìn)行提取參數(shù)的優(yōu)化,從而得到最佳提取工藝;再對(duì)金花小檗提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定,從而為我國(guó)小檗屬植物的深入開發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑

    金花小檗成熟果實(shí)于2020年10月采自西藏自治區(qū)林芝市八一鎮(zhèn),室溫陰干至恒重后,經(jīng)手工分離獲得金花小檗種子;2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、水溶性維生素E(Trolox)購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器

    JP-100ST超聲波清洗機(jī)(深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司);H1650醫(yī)用離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);752N紫外-可見分光光度計(jì)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 總黃酮提取將干燥的金花小檗種子粉碎并過(guò)60目篩備用。取0.1 g金花小檗種子粉末,以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為提取溶劑,采用超聲輔助法提取總黃酮,提取結(jié)束后經(jīng)離心(10 000 r/min,10 min),吸取上清液備用??傸S酮得率按式(1)計(jì)算:

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與總黃酮含量測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與樣品中總黃酮的檢測(cè)[15]。蘆?。≧T)標(biāo)液在0.036~0.360 g/L濃度區(qū)間內(nèi)與吸收值具有良好的線性關(guān)系,擬合方程為:y=1.280 6 x+0.083 6(R2=0.997 7),依據(jù)樣品液吸收值和擬合方程計(jì)算樣品液及干樣品中的總黃酮。

    1.3.3 單因素設(shè)計(jì)在功率400 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液固比30:1(mL/g)、提取溫度(30±2)℃和超聲時(shí)間20 min等固定條件下,每個(gè)因素設(shè)6個(gè)水平,其中在功率100~600 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)0~100%、液固比10:1~60:1(mL/g)、溫度30~80℃和超聲時(shí)間10~60min條件下,考察總黃酮得率對(duì)各單因素變化的響應(yīng)。

    1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)為得到金花小檗果實(shí)總黃酮最佳提取參數(shù),采用Box-Behnken法(Design-Expert 8.0.6版)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)結(jié)果分析基礎(chǔ)上,選取對(duì)總黃酮得率影響較大的超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比等3個(gè)因素,以總黃酮得率為響應(yīng)值,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸和優(yōu)化,并對(duì)最佳提取參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。響應(yīng)面設(shè)計(jì)見表1。

    1.3.5 抗氧化能力評(píng)價(jià)依據(jù)張鶴等[18]的檢測(cè)方法,評(píng)價(jià)樣品的DPPH自由基清除率,再根據(jù)清除率得出樣品的IC50值(半數(shù)抑制濃度)。依據(jù)文獻(xiàn)[18]的檢測(cè)方法,評(píng)價(jià)樣品的Fe3+還原能力,以Trolox當(dāng)量表示樣品FRAP值。依據(jù)Xu等[19]檢測(cè)方法,評(píng)價(jià)樣品的總自由基清除能力(TRAP),以Trolox當(dāng)量表示樣品TRAP值。

    1.3.6 數(shù)據(jù)處理每組試驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Microsoft Excel 2010、Design-Expert 8.06和Origin 9.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 超聲功率對(duì)提取得率的影響由圖1(a)可見,超聲功率100~500 W時(shí)總黃酮得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),超聲功率500~600 W時(shí)總黃酮得率略有下降。原因可能是一定條件下超聲波的空化效應(yīng)會(huì)加速黃酮類成分的釋放,總黃酮得率在500 W時(shí)最大,繼續(xù)增加功率,可能造成黃酮成分破壞,使總黃酮得率略有下降。

    2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取得率的影響如圖1(b)所示,乙醇體積分?jǐn)?shù)在0~60%時(shí)總黃酮得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)相同,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)總黃酮得率達(dá)到峰值,繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù),總黃酮得率逐漸迅速降低,乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)總黃酮得率僅為13.17 mg RT/g。原因可能是金花小檗種子的主要黃酮類成分極性接近60%乙醇,乙醇進(jìn)一步提高,過(guò)多醇溶性和脂溶性雜質(zhì)溶出,使得總黃酮得率下降[20]。

    2.1.3 液固比對(duì)提取得率的影響由圖1(c)可見,液固比為10:1~30:1時(shí)總黃酮得率隨液固比增大而迅速提高,在液固比為30:1時(shí)總黃酮得率達(dá)到峰值,液固比進(jìn)一步增大時(shí)總黃酮得率變化較小。原因可能是液固比適量增大使料液接觸更充分,促進(jìn)黃酮類化合物溶出;當(dāng)溶劑滿足溶質(zhì)溶解需要后,繼續(xù)增加溶劑量可能導(dǎo)致其他雜質(zhì)也被大量提取出來(lái),且溶劑過(guò)多易導(dǎo)致后續(xù)濃縮等工藝中的總黃酮損失,導(dǎo)致目標(biāo)成分得率下降[21,22]。

    2.1.4 提取溫度對(duì)提取得率的影響如圖1(d)所示,總黃酮得率在提取溫度為30~60℃時(shí)快速增加,60~70℃時(shí)增速變緩并在70℃時(shí)達(dá)到峰值,進(jìn)一步升高溫度時(shí)總黃酮得率略有下降。原因可能是黃酮類成分在乙醇溶液中的溶解度隨溫度升高而增大,但溫度過(guò)高又會(huì)破壞黃酮類化合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[23],從而導(dǎo)致黃酮提取率下降。

    2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)提取得率的影響由圖1(e)可見,超聲處理時(shí)間在10~40 min時(shí),總黃酮得率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而迅速提高,超聲40 min后總黃酮得率隨時(shí)間延長(zhǎng)呈小幅下降趨勢(shì)。原因可能是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致溶劑揮發(fā)增多,以及黃酮類成分氧化或分解[22],從而使總黃酮得率在提取溶液體系達(dá)到傳質(zhì)平衡后開始逐漸下降。

    圖1 提取條件對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 The effects of different conditions on the yields of the total flavonoid

    2.2 總黃酮提取參數(shù)的RSM優(yōu)化

    2.2.1 RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取超聲功率(x1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(x2)和液固比(x3)為響應(yīng)變量,以金花小檗種子總黃酮得率為響應(yīng)值(y),應(yīng)用Box-Behnken法,進(jìn)行3因素3水平的提取參數(shù)響應(yīng)面優(yōu)化,見表1。

    表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 The Box-Behnken design and results

    對(duì)表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析(表2),得到以金花小檗種子總黃酮得率y為因變量,以x1、x2、x3為自變量的回歸模型方程式(2):

    表2 方差分析Table 2 The analysis of variance

    由表2的方差分析結(jié)果可知模型的F值=65.98(P<0.000 1),達(dá)到極顯著水平,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;失擬項(xiàng)的P=0.190 5,不顯著,即模型的擬合度好;復(fù)相關(guān)系數(shù)(R2)為0.988 3,校正決定系數(shù)R2Adj為0.973 4,說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值高度相關(guān),可解釋97.34%的總黃酮得率響應(yīng)值變化。因此,所建模型的準(zhǔn)確性和可信度較高,可用于提取分析和預(yù)測(cè)總黃酮提取得率。

    2.2.2 RSM結(jié)果分析由圖2 a可見,液固比為30:1時(shí),等高線圖接近圓形,說(shuō)明超聲功率(x1)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(x2)的交互作用對(duì)得率的影響均不顯著[24]。由圖2 b可見,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),總黃酮得率隨功率提高而增加,在液固比加大情況下,總黃酮得率先降后升,且等高線為橢圓形,表明功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)之間具有交互作用。從圖2 c可知,超聲功率為500 W時(shí),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比提高,總黃酮得率均呈先增后降趨勢(shì),等高線為近圓形,說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比的交互作用對(duì)總黃酮得率影響不顯著。

    圖2 不同提取變量相互作用對(duì)總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for interactions between three extraction parameters on extraction yields of the total flavonoids

    2.2.3 最佳工藝條件與驗(yàn)證將實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶入軟件,分析得到最佳工藝條件:功率503W,乙醇體積分?jǐn)?shù)59%,液固比31:1,預(yù)測(cè)總黃酮得率最大值21.27 mg RT/g??紤]到實(shí)驗(yàn)操作的便捷性,對(duì)預(yù)測(cè)得到的最佳工藝進(jìn)行小幅調(diào)整:功率500 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)59%,液固比30:1,提取溫度70℃,超聲時(shí)間40 min,在此條件下平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn),測(cè)得TF的得率為(21.36±0.26)mgRT/g,與預(yù)測(cè)值誤差小于1%,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型關(guān)聯(lián)度較好,模型的預(yù)測(cè)結(jié)果可信度高。

    2.3 抗氧化活性

    最佳工藝下得到的提取物分別檢測(cè)其DPPH自由基清除率、FRAP值和TRAP值(圖3)。由圖3 a可見,金花小檗提取物對(duì)DPPH自由基的清除率隨其質(zhì)量濃度的增大而逐漸提高,提取物質(zhì)量濃度為111mg/L時(shí)的自由基清除率可達(dá)54.65%,提取物對(duì)DPPH的IC50值為89.46 mg/L,Vc對(duì)DPPH的IC50值為3.45 mg/L。由圖3 b可見,金花小檗提取物質(zhì)量濃度與FRAP值和TRAP值之間也呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系;提取物質(zhì)量濃度為111mg/L時(shí),F(xiàn)RAP值為19.69molTrolox/L,TRAP值為30.93 mol Trolox/L。

    圖3 金花小檗種子提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)Fig.3 The antioxidant properties of the B.wilsonae seed extracts

    3 討論

    目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)金花小檗種子總黃酮的研究相對(duì)較少,對(duì)其優(yōu)化提取以及抗氧化方面的研究亦尚屬空白。該試驗(yàn)采用超聲輔助乙醇提取金花小檗種子總黃酮,通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)獲得優(yōu)化提取參數(shù),得到最佳提取參數(shù)為超聲功率500 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、液固比30:1(mL:g)、提取溫度70℃、超聲時(shí)間40 min,該條件下金花小檗種子總黃酮提取得率為21.36 mg RT/g;進(jìn)一步利用3種不同體外實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)提取物的抗氧化活性,金花小檗種子質(zhì)量濃度為111 mg/L時(shí)DPPH自由基的清除率可達(dá)54.65%,F(xiàn)RAP值和TRAP值以每克樣品的Trolox當(dāng)量表示,分別為19.69 mol Trolox/L和30.93 mol Trolox/L,為綜合開發(fā)利用我國(guó)小檗屬植物資源提供了理論依據(jù)。

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