茶樹CsIQD基因家族的鑒定和表達模式分析

練珊珊，張寶會，姚新轉(zhuǎn)，呂立堂,※

[1.貴州大學(xué)茶學(xué)院,貴陽,550025貴州 貴陽550025；2.貴州大學(xué)生科科學(xué)院學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室（教育部），貴州 貴陽550025]

IQD家族蛋白質(zhì)構(gòu)成了一大類植物特有的鈣調(diào)素和鈣調(diào)素類蛋白（CAM/CML），廣泛特異性地存在于不同種屬的高低等植物當(dāng)中[1]。在自然界中，植物的生長和發(fā)育離不開鈣離子（Ca2+）的信號調(diào)節(jié)，鈣離子能夠協(xié)調(diào)促進植物體一系列的生長發(fā)育，同時根據(jù)外界自然環(huán)境的變化進行有助于植物自身的調(diào)節(jié)反應(yīng)[2]。CAM/CML能動態(tài)調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)的鈣離子濃度，通過復(fù)雜的鈣離子依賴和非依賴性的互作方式[3,4]，控制了一個廣泛的下游靶蛋白的多樣生化活動，這些生化活動包括蛋白質(zhì)-鈣信號形成、酶與代謝途徑的信號級聯(lián)反應(yīng)和能夠控制基因表達的核因子等[5]，所以IQD家族蛋白是Ca2+信號傳導(dǎo)的重要感受器。IQD家族蛋白有一個植物特異性中心結(jié)構(gòu)域（IQ67），由67個氨基酸殘基組成，IQ67結(jié)構(gòu)域內(nèi)含3個基序，分別是1-8-14基序、IQ基序和1-5-10基序，同時這3個基序都有1~3個重復(fù)[6]。IQD家族不是單一基因，它是一個多基因家族，組成其家族的成員眾多，在多種植物中表達，因此推測IQD基因家族的成員能在植物中發(fā)揮廣泛的作用。IQD家族最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥和水稻當(dāng)中[6]，水稻包含29個IQD基因，擬南芥中包含了33個IQD基因，這33個IQD被分為Ⅰ、Ⅱ、II和Ⅳ四個亞家族。IQD1是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第一個IQD家族的基因，IQD1基因主要功能是能夠編碼CaM結(jié)合核蛋白，對硫代葡萄糖苷代謝相關(guān)的多個基因的表達都有影響，同時IQD1基因過表達能夠使擬南芥的硫代葡萄糖表達量升高并提高防御能力[7]。擬南芥中發(fā)現(xiàn)的第二個IQD家族成員IQD22，它的表達受GA的抑制，但卻能被DELLA基因誘導(dǎo)表達，證明了IQD22在DELLA基因下游的GA3反應(yīng)的負反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[8]。將小麥的IQD基因在擬南芥中過表達后，擬南芥的子葉變細長[9]，后來在玉米、番茄、二穗短柄草、大豆和楊樹等作物中IQD蛋白也有陸續(xù)報道。值得注意的是，關(guān)于IQD蛋白的克隆和功能研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，在茶樹中未有報道。

茶樹作為我國農(nóng)業(yè)中重要的特色經(jīng)濟作物，其品質(zhì)的好壞尤為關(guān)鍵。而茶樹生長過程中，良好的適生環(huán)境就是保證茶葉品質(zhì)優(yōu)良的重要因素。在茶樹生長發(fā)育的整個階段，難免會遭受到干旱、鹽堿及高低溫等自然災(zāi)害影響，嚴重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的形成。IQD蛋白在植物的生長發(fā)育中影響重大，但目前的報道中，關(guān)于茶樹的IQD家族基因的分析和其逆境脅迫下的相關(guān)研究較少。因此，本研究基于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)Xia等研究人員所測的茶樹基因組數(shù)據(jù)[10,11]，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，明確了茶樹IQD基因家族的理化性質(zhì)等基本特征，同時還分析了其在茶樹不同組織和逆境脅迫下的表達模式，為進一步研究茶樹的生長發(fā)育調(diào)控機制奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 茶樹IQD家族基因的篩選

茶樹和擬南芥的全基因組數(shù)據(jù)、DNA、CDS、啟動子序列和染色體定位信息等從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫[10,11]（http://tpia.teaplant.org/）和擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫[12]（https://www.arabidopsis.org/）中下載。首先從茶樹蛋白數(shù)據(jù)庫Pfam（http://pfam.xfam.org） 中搜索IQD基因特有的保守結(jié)構(gòu)域模型（PF06203），利用該模型在茶樹蛋白數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP比對，設(shè)定閾值為E<1e-5，獲得假設(shè)的茶樹IQD基因。利用第一次鑒定到假設(shè)茶樹IQD基因序列重新構(gòu)建關(guān)于茶樹的IQD基因的隱馬爾可夫模型，進行第二次搜索鑒定獲得假設(shè)的茶樹IQD基因。將第二次獲得的茶樹假設(shè)IQD基因蛋白序列提交至NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）以及Pfam（http://pfam.xfam.org/）進行鑒定，確定保守結(jié)構(gòu)域，去掉多余的氨基酸序列，獲得最后的茶樹IQD基因序列。另外對茶樹IQD蛋白的分子大小、等電點、氨基酸長度和染色體位置和不穩(wěn)定系數(shù)等進行確認，通過TBtools和perl腳本進行分析。

1.2 系統(tǒng)進化樹、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守基序分析

為了分析茶樹、擬南芥和水稻IQD蛋白序列的差異，通過Muscle軟件進行多序列比對分析，同時通過該軟件上的功能將比對結(jié)果進行鄰接法（neighbor joining,NJ）（Boostrap=1000）分析構(gòu)建序列進化樹。茶樹IQD蛋白序列通過利用Muscle軟件多序列比對分析后，使用MEGA X軟件通過最大似然數(shù)法（Boostrap=1 000）構(gòu)建出系統(tǒng)進化樹。將CsIQD基因組DNA序列和編碼區(qū)基因序列上傳到TBtools軟件，對基因結(jié)構(gòu)進行分析，登錄MEME（http://meme-suite.org/）網(wǎng)站進行motif分析，其中motif參數(shù)數(shù)目設(shè)定為15，氨基酸長度設(shè)置為6~50 aa。使用TBtools對茶樹IQD基因的發(fā)育進化樹、保守結(jié)構(gòu)域、motif和基因結(jié)構(gòu)進行可視化。

1.3 染色體分布和啟動子順式作用元件分析

通過TBtools軟件給出茶樹基因組注釋信息確定CsIQD基因在染色體上的起始位置，然后將染色體定位利用TBtools工具進行可視化，并通過PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站對CsIQD基因上游2000bp基因順式作用元件進行分析，通過GSDS 2.0（http://gsds.ebi.pku.edu.en）進行可視化。

1.4 表達模式分析

根據(jù)鑒定出的茶樹CsIQD基因的編號，在TPIA（http://tpia.teaplant.org） 數(shù)據(jù)庫上下載Xia 2017上傳的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[10,11]，分別是茶樹不同組織（頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、莖和根）、鹽脅迫及PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫后的TPM值，利用TopHat和Cufflinks軟件分析將轉(zhuǎn)錄組閱讀框的全基因組映射，同時算出每一個CsIQD基因的FPKM值，找出差異表達的基因，通過R語言將結(jié)果制作成熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹IQD基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)預(yù)測

將基因序列比對搜索后，登錄SMART、Pfam和NCBI-CDD站上傳比對的候選基因，在線進行保守域的結(jié)構(gòu)驗證，最后獲得了38個茶樹IQD基因序列，并按照基因在染色體上的位置和它們之間的同源性進行命名。對茶樹IQD基因編碼的蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析見表1，結(jié)果顯示，最長的茶樹IQD蛋白CsIQD21基因有927個氨基酸殘基，最短的CsIQD11氨基酸殘基有306個；相對MW為34.3kD（CsIQD11）~101.3kD（CsIQD21）之間；理論PI值為5.58（CsIQD21）~11.35（CsIQD4）范圍內(nèi)，同時發(fā)現(xiàn)等電點大于7的CsIQD超過了94%（36個），由此得出CsIQD蛋白大多數(shù)含有堿性氨基；CsIQD的不穩(wěn)定系數(shù)在44.93~77.56之間，都屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪族氨基酸指數(shù)反應(yīng)了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，該家族的脂肪族氨基酸指數(shù)分布在50.11~81.58之間，說明熱穩(wěn)定性差異較大；蛋白質(zhì)的總平均親水性得分均小于0，說明CsIQD家族蛋白均為親水性蛋白質(zhì)。

表1 茶樹CsIQD基因家族基因的特征Table 1 The characteristics of the genes in the CsIQD gene family of Camellia sinensis

續(xù)表1

2.2 茶樹IQD系統(tǒng)進化、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

對鑒定出的38個茶樹IQD基因家族成員進行一個分類，并通過比對將34個擬南芥IQD蛋白序列和25個玉米IQD蛋白序列及38個茶樹的IQD蛋白序列一起構(gòu)建進化樹。通過進化樹可以看出，茶樹和擬南芥、玉米的IQD蛋白序列非常相似，同源性高。根據(jù)擬南芥和玉米在進化樹中同源蛋白的分類，將茶樹IQD家族能夠分為4個亞家族，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ（圖1）。這些分析結(jié)果都表明IQD在物種進化過程中具有高保守性，同時猜測這3個物種在系統(tǒng)進化分析上的相似，使得茶樹、玉米和擬南芥的IQD基因在生物學(xué)功能上可能也具有一致性。

圖1 茶樹、玉米和擬南芥IQD基因家族的系統(tǒng)進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of Camellia sinensis,maize and Arabidopsis IQD gene family

本研究還對茶樹IQD家族基因的38個基因的DNA序列和CDS區(qū)基因結(jié)構(gòu)進一步分析（圖2），通過MEME軟件分析茶樹CsIQD基因的保守基序，共鑒定出保守基序10個，按1~10依次對這10個保守基序進行命名；觀察其保守基序的組成，可以看出在系統(tǒng)進化上顯示歸于同一亞組的CsIQD基因保守結(jié)構(gòu)域大致相同。保守結(jié)構(gòu)域具有重要的功能，這種同亞組間保守結(jié)構(gòu)域的相似性，可能使得不同茶樹CsIQD基因在生物學(xué)功能上也具有相似性。在所有38個CsIQD基因中，發(fā)現(xiàn)的基序2是最常見的，隨后是基序1、基序3和5。除了CsIQD34和CsIQD32兩個基因外，在其他CsIQD基因中都有出現(xiàn)保守基序2，表明它可能承擔(dān)著重要且相似的功能。除了基序2，還檢測到一些亞家族特異性基序，例如，保守基序8只在亞家族Ⅰ和亞家族Ⅱ中存在；僅在亞家族Ⅰ中同時檢測到保守基序2和保守基序3。這些亞家族特異的基序都可能導(dǎo)致IQD基因在茶樹中的功能差異。

圖2 茶樹IQD基因的系統(tǒng)進、保守功能結(jié)構(gòu)域、基本基因結(jié)構(gòu)Fig.2 The systematic progress,conserved functional domains,and basic gene structure of Camellia sinensis IQD gene

2.3 染色體分布和啟動子順式作用元件分析

按照軟件給出的茶樹基因組染色體信息，對CsIQD基因染色體定位進行分析（圖3），結(jié)果顯示，除了CsIQD1、CsIQD3、CsIQD15、CsIQD25、CsIQD38這5個CsIQD基因定位不到染色體上外，其余的33個CsIQD基因都能不均等地定位到不同的染色體上，其中01號、02號、03號、15號染色體有4個CsIQD基因，相比其他染色體所包含的基因數(shù)更多，而06號染色體不含CsIQD基因。此外，茶樹不同染色體組中基因的分布同樣不均等，12號染色體有3個CsIQD基因，04、05、07、09、14號染色體有2個CsIQD基因，08、10、11、13號染色體只包含了1個CsIQD基因。這些結(jié)果都表明CsIQD基因在茶樹在進化過程中可能發(fā)生了基因的復(fù)制或丟失。

圖3 茶樹CsIQD基因的染色體分布Fig.3 The chromosome distribution of CsIQD gene in Camellia sinensis

對茶樹CsIQD基因上游2 000 bp的基因組序列 進行順式作用元件分析。結(jié)果顯示（圖4），其啟動子序列中所包含的順式作用元件數(shù)量和種類眾多。有與激素響應(yīng)調(diào)控相關(guān)的，如響應(yīng)脫落酸的ABRE、ABRE2和ABRE4等，響應(yīng)赤霉素調(diào)控的GARE-motif和TATCbox順式作用元件，響應(yīng)生長素的元件TGA-element、MeJA有關(guān)的元件CGTCA-motif和TGACG-motif以及水楊酸相關(guān)元件TCA-element等；還有與光調(diào)控和生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，如CAT-box、AT-rich、G-box和MRE等。在CsIQD3、CsIQD38、CsIQD9、CsIQD25和CsIQD28等基因啟動子上還發(fā)現(xiàn)了CGTCA-motif、WUN-motif、W-box和WRE3這些響應(yīng)生物脅迫的順式作用元件，這些元件的富集都與茶樹的生物防御相關(guān)。IQD基因與植物的非生物脅迫關(guān)系更為密切，在對IQD基因啟動子順式作用元件進行分析時，發(fā)現(xiàn)大量的與環(huán)境相關(guān)的響應(yīng)元件在CsIQD上富集，如響應(yīng)鹽脅迫的MBS，環(huán)境脅迫相關(guān)的ABRE、MYB、MYC、STRE、TCA和TGACG-motif等。通過對茶樹38個CsIQD基因啟動子的順式作用元件分析可以看出，CsIQD在激素調(diào)節(jié)、光調(diào)控和生長發(fā)育以及脅迫響應(yīng)等都有涉及，表明CsIQD基因家族參與了茶樹的整個生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程。

圖4 CsIQD基因中的順式作用元件分析Fig.4 The analysis of cis-acting elements of CsIQD gene

2.4 CsIQD基因在茶樹中的不同組織表達分析

為了分析CsIQD基因在茶樹不同部位的表達量，進一步明確CsIQD在茶樹中的表達模式。本研究從茶樹TPIA數(shù)據(jù)庫中下載了38個CsIQD基因在茶樹8個不同組織（頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖、花和果）的轉(zhuǎn)錄組TPM表達量數(shù)據(jù)，通過分析顯示（圖5），CsIQD在茶樹不同組織中具有表達特異性，如在頂芽中，有一半以上的CsIQD基因表達量都較高，CsIQD5、CsIQD31和CsIQD38的表達水平最高，CsIQD4和CsIQD35幾乎不表達；CsIQD24、CsIQD28只在嫩葉中表達量高，CsIQD1、CsIQD2、CsIQD6、CsIQD9、CsIQD14和CsIQD30也有表達，在其余組織中表達量低甚至幾乎不表達；在根中，只有CsIQD33表達量高，其余CsIQD基因表達水平都較低；在莖中，CsIQD11、CslQD12、CsIQD22、CslQD25、CsIQD32、CslQD36和CsIQD37的表達量高；在花中CsIQD4、CsIQD9、CslQD13、CsIQD3、CsIQD15、CsIQD30、CslQD29和CsIQD34的表達量高；在老葉中，只有CsIQD4、CsIQD5的表達量高；在果實中除了CsIQD19，其余表達量都很低；在成熟葉中CsIQD7表達量高，其余幾乎不表達。以上結(jié)果表明，不同CsIQD基因可能參與茶樹的不同生長發(fā)育過程。

圖5 不同組織中茶樹CsIQD基因表達形式Fig.5 Tea plant CsIQD gene expression patterns in different tissues of Camellia sinensis

2.5 CsIQD基因在干旱脅迫和鹽脅迫下的表達模式

對CsIQD基因在干旱脅迫處理（0 h、24 h、48 h和72 h）、鹽脅迫處理（0 h、24 h、48 h和72 h）后的表達數(shù)據(jù)進行分析（圖6）。結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，與其他基因的表達水平相比，CsIQD3、CsIQD4、CsIQD15、CsIQD36和CsIQD37的表達量較高；CsIQD17、CsIQD1、CsIQD2、CsIQD33、CsIQD35、CsIQD13、CslQD31、CsIQD5和CsIQD38等基因的表達量在干旱脅迫下被抑制，其中CsIQD36、CsIQD37基因在48 h時上調(diào)表達，CsIQD21在72 h時基因略呈上調(diào)表達，CslQD3、CslQD15在干旱脅迫下呈下調(diào)表達趨勢，CsIQD1、CsIQD2、CsIQD4和CsIQD33等基因不受干旱脅迫處理的調(diào)控。在鹽脅迫下，與其他基因的表達水平相比，CslQD4、CsIQD3、CslQD15、CslQD36和CslQD37的表達量較高，CslQD19的表達量在鹽處理24h時被顯著誘導(dǎo)上調(diào)，而在48 h時下調(diào)，總體基本呈先升高后降低的趨勢，CslQD36、CslQD37的表達量也在鹽處理24 h有略微上調(diào)，而72 h后恢復(fù)，CslQD2、CslQD4、CslQD33和CslQD35等基因不受鹽脅迫處理的調(diào)控。

圖6 不同脅迫下茶樹CsIQD基因表達形式(a.干旱脅迫；b.鹽脅迫)Fig.6 CsIQD gene expression under different stresses of Camellia sinensis(a.drought stress;b.salt stress)

3 討論

基因家族已在多個物種中被鑒定，其中玉米IQD基因家族含有26個成員[13]，番茄IQD基因家族含有33個成員[14]，大豆IQD基因家族含有67個成員[15]，楊樹IQD基因家族含有67個成員[16]，二穗短柄草IQD基因家族含有12個成員[17]。隨著各物種全基因組的公布，對IQD基因家族的研究也越來越深入。本研究在全基因組水平上共鑒定到茶樹CsIQD基因38個。CsIQD基因等電點范圍為5.58~11.35，大于94%的茶樹CsIQD蛋白都是堿性，猜測其會在堿性亞細胞環(huán)境發(fā)揮其功能，和玉米CsIQD成員的蛋白性質(zhì)大體相似[13]。系統(tǒng)進化分析將38個茶樹IQD基因分成了4個亞家族，其中Ⅰ、Ⅱ亞家族分別包含13個IQD成員，Ⅲ、Ⅳ亞家族分別包含6個IQD成員，符合植物中CsIQD基因在不同亞家族的分布特征。在對茶樹IQD基序分析時，其中每個基因結(jié)構(gòu)中包含不同種類的基序，最多的包含10個基序，最少的則僅含有3個基序，從進化的角度上可以看出，進化關(guān)系較近的CsIQD基因無論從基序的種類還是長度都較為相似，這可能是這些基因在不同的組織中發(fā)揮作用并經(jīng)過長期的進化和功能的選擇造成的，形成各自不同的基序。一些結(jié)構(gòu)較短的基因，如CsIQD8所含較少數(shù)量的基序，若在以后的功能研究中發(fā)現(xiàn)具有鈣信號傳導(dǎo)的相關(guān)作用，那么這個基因所含有的基序可能就是發(fā)揮其作用的必要基序。

IQD蛋白是鈣離子信號傳導(dǎo)的下游靶點，在植物對環(huán)境信號的響應(yīng)中起著重要作用。因此，近年來對植物IQD基因家族的研究逐漸增多，發(fā)現(xiàn)IQD基因參與到植物生長發(fā)育的整個過程以及對脅迫響應(yīng)的基礎(chǔ)防御反應(yīng)中，并且少數(shù)IQD的功能也得到初步驗證[18]。例如：AtIQD1影響了芥子油苷代謝相關(guān)基因的表達，抑制擬南芥中芥子油苷的產(chǎn)生，同時刺激擬南芥的防御機制[19]。IQD22參與了GA響應(yīng)下游RGA功能的負反饋調(diào)節(jié)[20]。番茄IQD12的過表達，導(dǎo)致了其形態(tài)的變更，影響了子葉、葉、花等器官和葉脈的形狀[21]。本實驗發(fā)現(xiàn)在茶樹老葉中CsIQD35基因表達量高，根部CsIQD33基因表達高，嫩葉中CsIQD24和CsIQD28基因表達高，說明CsIQD基因在茶樹的不同組織表達具有特異性，不同組織中有不同CsIQD基因發(fā)揮功能。非生物逆境表達模式分析發(fā)現(xiàn)，茶樹CsIQD基因還參與干旱和鹽脅迫等。不同脅迫下CsIQD4基因的表達量都是最高的，其次是CsIQD3、CsIQD13、CsIQD36和CsIQD37，這些基因的啟動子上也富集了許多環(huán)境脅迫相關(guān)的順式作用元件。這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果都表明茶樹的CsIQD基因有與其它物種中IQD相似的功能，響應(yīng)非生物逆境脅迫和植物防御反應(yīng)，廣泛的參與到茶樹的整個生長發(fā)育過程中。

茶樹作為我國特色農(nóng)業(yè)的重要經(jīng)濟作物，一旦遭遇干旱、土壤鹽堿化等自然災(zāi)害和環(huán)境脅迫都會影響其生長發(fā)育，導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，造成經(jīng)濟損失[22]。本研究通過對茶樹CsIQD基因家族鑒定和表達模式分析，發(fā)現(xiàn)CsIQD基因是影響茶樹生長發(fā)育和響應(yīng)多種激素調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素，也參與了茶樹響應(yīng)不同脅迫的過程。填補了在木本植物中的研究缺失，為進一步深入了解CsIQD基因參與茶樹生長發(fā)育和品質(zhì)形成及基礎(chǔ)防御機制等方面奠定了基礎(chǔ)。但關(guān)于CsIQD基因家族對激素和逆境的響應(yīng)，都只是基于基因組和轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析了解，其具體作用機理和確切功能還需要進一步實驗對其進行深入探究。