基于微小RNA-mRNA-信號通路調(diào)控網(wǎng)絡探討肝細胞癌的潛在生物學標志物▲

王挺帥 王 娜 張榮臻 王明剛 黃少東 吳 聰 毛德文,4

(1 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肝病科，南寧市 530023，電子郵箱：603085856@qq.com；2 廣西骨傷醫(yī)院脾胃呼吸科，南寧市 530023；3 廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，南寧市 530023；4 廣西壯瑤藥技術研究中心，南寧市 530023)

在全球范圍內(nèi)，肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病后患者生存時間僅有6個月左右，被稱為“癌中之王”[1]。過去的幾十年里疾病診斷、防治等方面的研究顯著進步，全球大多數(shù)國家的肝癌發(fā)病率和死亡率均顯著下降[2]。然而，亞洲地區(qū)每年仍有58萬多例新發(fā)肝癌病例，肝癌仍然是一個有待解決的挑戰(zhàn)，需要深入研究[3]。與其他癌癥一樣，基因變異、細胞環(huán)境和機體內(nèi)環(huán)境被認為是肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉移的重要機制。

微小RNA(mircoRNA,miRNA)是一類非編碼RNA，已被證實與多種疾病特別是惡性腫瘤相關。研究表明，miRNA與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預后有著密切的關系[4]。例如，miRNA-519、miRNA-106b、miRNA-301、miRNA-423、miRNA-33a、miRNA-24等表達上調(diào)，可促進肝癌細胞增殖、遷移[5]；miRNA-122、miRNA-124、miRNA-203、miRNA-199a-5p等表達下調(diào)，可促進肝癌細胞凋亡、抑制肝癌細胞增殖[6-7]。因此，miRNA具有腫瘤抑制因子或癌基因的作用，可作為肝癌診斷、治療和預后的特異性標志物。

了解肝癌的發(fā)生過程及患者預后狀況是有效治療肝癌的前提之一。雖然在過去的幾十年中，很多學者對肝癌的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)和差異表達miRNA(differentially expressed miRNAs,DEmiRNAs)進行了研究，并報告了它們的一些功能，但由于對基因和miRNA的比較分析受到限制，它們?nèi)绾瓮ㄟ^分子途徑相互作用尚不明確。近年來，微陣列技術已被廣泛應用于腫瘤相關遺傳變異的鑒定。目前，通過生物信息學的方法，可以對微陣列技術產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行處理，從而了解DEGs和miRNA之間的相互作用，特別是相互作用網(wǎng)絡中的通路，最終分析它們在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的潛在機制[8-10]。本文通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取肝癌相關的miRNA表達譜，分析肝癌組織和正常組織之間的DEGs和DEmiRNAs，隨后篩選肝癌的潛在靶基因，對其可能的分子機制進行描述，旨在尋找最特異、最敏感的肝癌分子標志物，進而提高診治水平以改善患者預后。

1 資料與方法

1.1 篩選miRNA和mRNA信息 (1)提取miRNA信息。從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中檢索肝癌，設置關鍵詞為hepatocellular carcinoma(或HCC、liver cancer)、miRNA，得到miRNA相關信息。選擇組織為人(Homo sapiens)，研究類型為非編碼RNA微陣列分析(non-coding RNA profiling by array)，進一步篩選。再根據(jù)以下標準進行了第2次篩選：① 研究樣本量≥10個；② 研究對象為組織樣本而不是細胞樣本；③ 僅研究肝組織樣本；④ 應提供正常對照樣本或正常鄰近組織。(2)提取mRNA信息。從GEO數(shù)據(jù)庫中檢索肝癌，設置關鍵詞為hepatocellular carcinoma(或HCC、liver cancer)、mRNA，得到mRNA相關信息。選擇組織為人(Homo sapiens)，研究類型為Expression profiling by array，進一步篩選。第2次篩選標準同miRNA。

1.2 DEmiRNAs和DEGs的篩選 采用R語言中l(wèi)imma包進行異DEmiRNAs和DEGs的篩選，設置閾值=2，矯正后的P值閾值為0.05。并用pheatmap包繪制DEGs和DEmiRNAs熱圖。

1.3 篩選肝癌的潛在靶基因 通過miRDB(http://mirdb.org/)、miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)和TargetScan(http://www.targetscan.org/mamm_31/)3個數(shù)據(jù)庫進行DEmiRNAs靶基因的篩選。再將篩選出來的靶基因與DEGs取交集，最終得到肝癌的潛在靶基因。采用Venny 2.1工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)進行對比分析。

1.4 功能和通路富集分析 利用David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)上傳1.3中獲取的交集靶基因，進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析，包括生物學過程、細胞組成、分子功能，同時進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路分析(P<0.05)。

1.5 miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡的建立 采用Cytoscape軟件構建miRNA-mRNA-通路的調(diào)控網(wǎng)絡，并用Network Analyzer進行拓撲學分析，計算其拓撲學參數(shù)，從中得到重要miRNA、mRNA及信號通路，基于構建的調(diào)控網(wǎng)絡探討原發(fā)性肝癌的生物學過程及相關作用機制。

2 結 果

2.1 miRNA、mRNA、DEmiRNAs和DEGs的篩選結果 通過GEO數(shù)據(jù)庫獲得符合篩選標準的肝癌相關miRNA表達譜 (GSE112264)和mRNA表達譜(GSE118916)，前者包括正常組樣本41例、肝癌組樣本50例，后者包括正常組樣本8例、肝癌組樣本24例。采用limma包篩選得到213個DEmiRNAs和256個DEGs，熱圖見圖1。

DEmiRNAs DEGs

2.2 miRNA-mRNA交集 從miRDB、miRTarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫中共識別出4 010個DEmiRNAs靶基因。再將DEmiRNAs靶基因與DEGs取交集，獲得肝癌潛在靶基因34個(見圖2)。選擇潛在靶基因及與其對應且存在負調(diào)控關系的miRNA作為miRNA-mRNA靶點對，最終共獲得55對miRNA-mRNA基因對，包括23個潛在靶基因和17個miRNA，其中miRNA均為表達上調(diào)，而危險基因均為表達下調(diào)，見表1。

圖2 肝癌潛在靶基因的韋恩圖

表1 miRNA-mRNA基因對

2.2 GO富集分析和KEGG信號通路分析 GO富集分析結果顯示，肝癌潛在靶點基因涉及22個生物學過程、8種分子功能、8個細胞組分。見圖3。其中生物學過程主要包括調(diào)節(jié)細胞死亡、多細胞生物過程的正向調(diào)節(jié)、生物學過程的正向調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細胞凋亡、組織發(fā)育、內(nèi)源性刺激的應答、調(diào)節(jié)細胞連接、調(diào)節(jié)程序性細胞死亡等。

圖3 生物學過程的GO富集分析(前20個生物學過程)

KEGG信號通路分析結果顯示，共得到88條信號通路，剔除與肝癌無關的31條信號通路，按其功能分類，主要富集在7個類型的通路上，包括細胞增殖與死亡、免疫系統(tǒng)、信號轉導、運輸和分解代謝、癌癥、消化系統(tǒng)及氨基酸代謝，涉及p53 信號通路、細胞凋亡、Th17分化、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)信號通路、核因子κB信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路、FoxO信號通路、Hippo信號通路、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號通路等，見圖4(圖4只顯示前20個信號通路，未顯示完全)。

圖4 KEGG信號通路分析(前20個信號通路)

2.3 miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡 采用Cytoscape構建miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡，并用Network Analyzer進行拓撲學分析。根據(jù)連接度(Degree值)大小，得到排名靠前的危險miRNA為hsa-miRNA-195-5p、hsa-miRNA-16-5p、hsa-miRNA-124-3p、hsa-miRNA-107、hsa-miRNA-103a-3p等，危險基因有轉錄因子FOS、生長停滯和DNA損傷可誘導蛋白45γ(growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma,GADD45G)、環(huán)指蛋白125(ring finger protein 125,RNF125)、含鋅指和BTB結構域蛋白質(zhì)16(zinc finger and BTB domain containing 16,ZBTB16)、C-X-C基序趨化因子配體12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)、生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)、R-海綿蛋白-3(R-spondin 3,RSPO3)、碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2,CA2)、DNA結合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1,ID1)、肌肽二肽酶1(carnosine dipeptidase 1,CNDP1)、磷脂磷酸酶3(phospholipid phosphatase 3,PLPP3)、早期生長應答因子1(early growth response 1,EGR1)等，信號通路為癌癥通路、癌癥中的轉錄失調(diào)、細胞凋亡、MAPK信號通路、肝細胞癌、p53 信號通路、膽汁分泌等。見圖5、表2。

圖5 miRNA-mRNA-通路的調(diào)控網(wǎng)絡圖

表2 miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡拓撲學特征

3 討 論

miRNA是一類由內(nèi)源性基因編碼的長度為20～25個核苷酸的非編碼RNA，主要與3′-非翻譯區(qū)的靶向mRNA結合，miRNA能促進靶向mRNA的降解或抑制其翻譯，最終調(diào)節(jié)靶基因的生物學功能[11]。同一miRNA可以調(diào)控不同的基因，而同一基因可由不同的miRNA調(diào)控。在過去的幾十年里，已有研究充分證實了miRNA參與多種生理和病理事件的發(fā)生，特別是在腫瘤方面[12]。miRNA與腫瘤的關系可概括為以下幾個方面：(1)miRNA作為癌基因或抑癌基因，參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關基因的表達調(diào)控，在腫瘤的增殖、遷移、侵襲、轉移以及血管生成、細胞周期進展、凋亡、自噬等過程中發(fā)揮著重要作用[13-14]。(2)miRNA在人腫瘤中具有組織和疾病特異性，提示miRNA可作為腫瘤早期診斷和預后預測的新生物學標志物[15]。(3)miRNA在腫瘤治療中的應用，主要包括抑制miRNA和替換miRNA兩種策略。在中國，肝癌是發(fā)病率排名第4位的惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第2大原因[1]。然而，肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制仍有待闡明，這嚴重阻礙了對肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和有效治療。因此，從miRNA深入研究miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡，有助于進一步探明肝癌的發(fā)生和進展過程，建立早期篩查和預后評估的危險模型，以及研發(fā)抗肝癌的藥物。

通過生物信息學分析，我們共篩選出與肝癌相關的213個DEmiRNAs以及256個DEGs，取交集后獲得34個肝癌潛在靶基因，這些基因參與調(diào)節(jié)細胞死亡、多細胞生物過程的正向調(diào)節(jié)、生物學過程的正向調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細胞凋亡、組織發(fā)育、內(nèi)源性刺激的應答、調(diào)節(jié)細胞連接、調(diào)節(jié)程序性細胞死亡等生物學過程。最終獲得55對miRNA-mRNA基因對，包括23個潛在靶基因和17個miRNA；通過構建miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡，篩選出肝癌的危險miRNA為hsa-miRNA-195-5p、hsa-miRNA-16-5p、hsa-miRNA-124-3p、hsa-miRNA-107、hsa-miRNA-103a-3p等，危險基因有FOS、GADD45G、RNF125、ZBTB16、CXCL12、EGR1等，涉及信號通路包括癌癥通路、癌癥中的轉錄失調(diào)、細胞凋亡、MAPK信號通路、肝細胞癌、p53 信號通路、膽汁分泌等。在miRNA-mRNA-通路調(diào)控網(wǎng)絡中，F(xiàn)OS的連接度最高，與hsa-miRNA-221-3p、hsa-miRNA-29b-3p、hsa-miRNA-222-3p 3個miRNA相關，涉及癌癥通路、細胞凋亡、MAPK信號通路等11條信號通路。

Fos蛋白是原癌基因c-Fos的表達產(chǎn)物，由堿性氨基酸組成，F(xiàn)os家族為細胞核內(nèi)重要的轉錄因子，其編碼的蛋白質(zhì)為細胞核內(nèi)重要的癌蛋白[16]。Fos蛋白可與Jun蛋白結合形成具有轉錄激活活性的異二聚體，即轉錄因子激活子蛋白1(activator protein 1,AP-1)，調(diào)控細胞存活、增殖和分化，參與癌癥的形成及其上皮間質(zhì)轉化[17]。Bakiri等[18]構建肝癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)肝細胞特異性c-Fos缺失可防止肝癌的發(fā)生，而c-Fos表達增加有利于肝細胞轉化和癌變。有研究顯示，AP-1的活化可通過MAPK信號通路介導Fos、Jun蛋白的活化和磷酸化，從而促進癌癥的進展[19]。除此之外，AP-1在調(diào)控細胞死亡和存活方面起重要作用，也是細胞轉化的重要標志。GADD45G又稱為CR6，屬于GADD45蛋白家族。GADD45G可影響細胞周期，調(diào)控G/M細胞周期點、維持基因組穩(wěn)定性，在細胞信號轉導過程中起重要作用，也與DNA損傷修復密切相關[20]。此外，GADD45G可負調(diào)控細胞生長，抑制腫瘤細胞生長并促進其凋亡。RNF125是一種泛素連接酶，是RIG-I的負調(diào)控因子，可通過介導視黃醇誘導基因-I的k48連接多泛素化從而導致視黃醇誘導基因-I蛋白被蛋白酶體降解。泛素化幾乎參與所有細胞過程，其功能包括內(nèi)化和溶酶體靶向、蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)、亞細胞分布的改變、轉錄的調(diào)節(jié)、DNA修復和跨膜信號的傳播[21]。有學者發(fā)現(xiàn)，RNF125可通過激活TGF-β1-SMAD3-ID1信號通路促進膽囊腫瘤的浸潤和轉移[22]?；|(zhì)衍生因子1α，也稱為CXCL12，是CXCR4和CXCR7的特異性配體，三者共同推動了胚胎發(fā)育過程中的祖細胞遷移。有研究表明，CXCL12可能在肝癌的轉移中發(fā)揮重要作用，促進腫瘤細胞的遷移[23]。ESR1可以編碼轉錄因子，增強對不同組織類型的雌激素和生長因子等的刺激反應[24]。有學者發(fā)現(xiàn)，ESR1可能在肝癌中發(fā)揮潛在的抑癌作用，并與某些腫瘤抑制因子(例如HNF4A和PPAR)存在關聯(lián)[25]。此外，也有研究顯示，ESR1可以抑制白細胞介素6介導的炎癥過程，減輕肝損傷和肝細胞代償性增殖[26]。

越來越多的證據(jù)表明，miRNA表達失調(diào)是肝癌發(fā)病機制的重要組成部分。本研究最后篩選出來的17個miRNA中，根據(jù)拓撲學分析結果可知hsa-miRNA-195-5p是最顯著的miRNA之一，以ZBTB16、RNF125、GHR、PPAP2B等為靶點。hsa-miRNA-195-5p在多種癌癥中都有表達，包括肝癌、胃癌、乳腺癌和腎上腺皮質(zhì)癌。hsa-miRNA-195-5p在肝癌細胞中的過度表達可降低PHF19的水平，導致肝癌細胞在體外的侵襲、遷移和增殖受到抑制[27]。miRNA-221是人類腫瘤中最常見且持續(xù)表達上調(diào)的miRNA之一，被認為是腫瘤的啟動子。最近的一項研究表明，miRNA-221的過度表達可以加速肝細胞的增殖，并可能促進肝腫瘤的發(fā)生[28]。本研究中，has-miRNA-221和has-miRNA-222是顯著上調(diào)的關鍵miRNA， 都與ESR1、FOS等DEGs關聯(lián)。有學者發(fā)現(xiàn)， has-miRNA-221可與ESR1、CXCL12、FOS等DEGs相互作用[14]；而has-miRNA-222是研究中表達上調(diào)最顯著的miRNA，與ZBTB41相關聯(lián)并可通過激活蛋白激酶B途徑增強肝癌細胞的侵襲性和運動性[14]。

綜上所述，F(xiàn)OS、GADD45G、RNF125、ZBTB16、CXCL12、EGR1等DEGs，以及hsa-miRNA-195-5p、hsa-miRNA-16-5p、hsa-miRNA-124-3p、hsa-miRNA-107、hsa-miRNA-103a-3p等DEmiRNAs，或可為肝癌的診斷和治療提供新的線索。然而，缺乏實驗驗證是本研究的局限之一，在今后的研究中，將通過實時定量PCR和蛋白免疫印跡等實驗對這些生物信息學分析的預測結果進一步加以驗證。