外周血輔助性T細(xì)胞9細(xì)胞因子與過(guò)敏性鼻炎患者疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性▲

何 瑋 胡 敏 梁興明 趙世杰 唐 軍 楊強(qiáng)威 林華國(guó) 藍(lán) 英 陳 龍

(廣西南寧市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，南寧市 530031，電子郵箱：a15677005435@sina.com)

過(guò)敏性鼻炎主要是由IgE介導(dǎo)組胺釋放，并由多種細(xì)胞因子和免疫活性細(xì)胞參與的鼻黏膜炎性疾病，是一種臨床較為常見的呼吸道過(guò)敏性疾病[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)過(guò)敏性鼻炎發(fā)病率一直居高不下，并且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，其在青少年群體以及過(guò)敏體質(zhì)群體發(fā)病率較高[3]。過(guò)敏性鼻炎的主要臨床表現(xiàn)為鼻癢、鼻塞、噴嚏、清水樣鼻涕，對(duì)患者的生活質(zhì)量以及身體健康均造成嚴(yán)重的影響，但是目前過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此，研究過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病機(jī)制對(duì)患者的治療具有重要意義[4]。本研究探討輔助性T[淋巴]細(xì)胞(helper T cell，Th)-9細(xì)胞因子與過(guò)敏性鼻炎患者疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年8月至2018年12月在我院門診接受治療的100例過(guò)敏性鼻炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的過(guò)敏性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：病歷資料不全患者；呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤患者；心、腎、肺等重要器官衰竭或功能不全的患者；有精神病史的患者。按照患者病情嚴(yán)重程度[6]分為輕度組36例、中度組49例、重度組15例。其中輕度組男性23例，女性16例，年齡25～41(33.1±6.3)歲；中度組男性27例，女性22例，年齡26～43(34.5±6.8)歲；重度組男性9例，女性6例，年齡26～42(34.1±6.3)歲。3組患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情通知書，本研究已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可[倫申批號(hào)：(2020)倫審第(53)號(hào)]。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：抽取所有患者治療前清晨空腹手臂內(nèi)側(cè)靜脈血3 mL，使用枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝處理，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，并分兩管收集，分別用于流式細(xì)胞術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。另抽取所有患者治療前清晨空腹手臂內(nèi)側(cè)靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心20 min后分離上層血清，在-70℃環(huán)境中保存待檢。

1.2.2 Th9細(xì)胞比例的檢測(cè)：將待測(cè)標(biāo)本傳代至孔板中，并在37℃、5%CO2的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)2 h，加入0.25%胰蛋白酶消化，以2 000 r/min離心5 min后使用磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，共清洗3 min，再次以2 000 r/min離心5 min后收取細(xì)胞，加入1 mL碘化丙啶染液，在避光的常溫環(huán)境中放置1 h，使用磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行洗滌5 min后在各管中加入150 μL固定劑，再加入0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液混合均勻制備為懸液，使用流式細(xì)胞儀[貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司，型號(hào)：CytoFLEX]檢測(cè)Th9細(xì)胞比例。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄因子PU.1及干擾素調(diào)節(jié)因子4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)血漿轉(zhuǎn)錄因子PU.1及干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4) mRNA相對(duì)表達(dá)水平，嚴(yán)格按照定量PCR儀(西安歐拓機(jī)電設(shè)備有限公司，型號(hào)：QTOWER2.2)的操作說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系：稀釋10倍的PCR緩沖液2.5 μL，氯化鎂溶液1.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，最后加水配成25 μL。反應(yīng)條件：94℃ 1 min；55℃ 1 min；72℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延長(zhǎng)5 min，最少重復(fù)3次，以內(nèi)參U6為參照，采用2-△△Ct方法計(jì)算PU.1 mRNA及IRF4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 白細(xì)胞介素9、白細(xì)胞介素4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1水平的檢測(cè)：使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-9、IL-4及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)水平，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批次：20170201)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5 癥狀與生活質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)：(1)入院次日，使用鼻結(jié)膜炎生存質(zhì)量調(diào)查問(wèn)卷(Rhinoconjunctivitis Quality of Life Questionnaire，RQLQ)評(píng)分[7]對(duì)所有患者的癥狀與生活質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括7個(gè)方面，共28個(gè)小項(xiàng)，分別為：(1)鼻部癥狀：鼻塞、鼻涕、噴嚏和涕倒流；(2)眼部癥狀：眼癢、流淚、眼痛和眼腫；(3)非鼻眼部癥狀：工作效率下降、注意力難以集中、精力不足、疲倦、疲憊不堪、口渴和頭痛；(4)行為問(wèn)題：需攜帶面巾紙、需揉鼻或眼和需反復(fù)吸鼻；(5)睡眠：入睡困難、夜間醒來(lái)次數(shù)和睡眠質(zhì)量不高；(6)日?；顒?dòng)：根據(jù)列表中選擇3項(xiàng)日?；顒?dòng)；(7)情感反應(yīng)：沮喪感、無(wú)耐心或煩躁、易怒和因癥狀而感到尷尬。每個(gè)單項(xiàng)最高分為6分，得分越高說(shuō)明疾病對(duì)患者造成的困擾越嚴(yán)重。(2)入院次日，使用視覺模擬量表(Visual Analogue Scale，VAS)評(píng)分[8]評(píng)價(jià)患者鼻部癥狀嚴(yán)重程度：在紙上劃出10 cm長(zhǎng)的直線，按毫米劃格，一端為無(wú)痛，另一端為極痛?；颊吣繙y(cè)后根據(jù)自身情況以直線上無(wú)痛端為起點(diǎn)，用筆劃出與其疼痛強(qiáng)度相符合的某點(diǎn)，測(cè)量點(diǎn)在直線上與無(wú)痛端的距離，重復(fù)2次，取平均值。按患者劃出直線長(zhǎng)短評(píng)價(jià)疼痛程度，其中0～2 cm為無(wú)痛，3～5 cm為輕度疼痛，有輕微疼痛感，6～8 cm為中度疼痛，有明顯疼痛感，8 cm以上為重度疼痛，有劇烈疼痛感。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；使用多因素Logistic回歸分析Th9細(xì)胞因子與過(guò)敏性鼻炎患者疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組患者外周血Th9細(xì)胞比例的比較 3組患者外周血Th9細(xì)胞比例由高到低為重度組>重度組>輕度組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組患者外周血Th9細(xì)胞比例的比較(x±s，%)

2.2 3組患者血漿PU.1 mRNA、IRF4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 重度組血漿PU.1 mRNA、IRF4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均高于中度組與輕度組，且中度組血漿PU.1 mRNA、IRF4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均高于輕度組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組患者血漿PU.1 mRNA、IRF4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.3 3組患者血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平的比較 重度組血清IL-9、IL-4水平、TGF-β1水平均高于中度組與輕度組，且中度組血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均高于輕度組(均P<0.05)。見表3。

表3 3組患者血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平的比較(x±s)

2.4 3組患者RQLQ評(píng)分及VAS評(píng)分的情況 重度組RQLQ量表各項(xiàng)目評(píng)分和鼻部VAS評(píng)分均高于中度組、輕度組。見表4。

表4 兩組研究對(duì)象癥狀及生活質(zhì)量評(píng)分的情況(x±s，分)

2.5 多因素Logistic回歸分析 以[(RQLQ評(píng)分+VAS評(píng)分)/2]為因變量(>3分賦值為1，≤3分賦值為0)，以PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、IRF4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平為自變量(非正常水平均賦值為1，正常水平均賦值為0)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析， 結(jié)果顯示，血漿PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、IRF4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均是過(guò)敏性鼻炎嚴(yán)重程度的影響因素(均P<0.05)。見表5。

表5 過(guò)敏性鼻炎患者疾病嚴(yán)重程度多因素Logistic回歸分析

3 討 論

研究表明，Th細(xì)胞與過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞在過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病過(guò)程中均起到重要作用，這是由于Th1細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)干擾素γ的分泌，介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫[9]，而Th2細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)IL-4、IL-5與IL-13的分泌，從而起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用[10]。盡管Th1/Th2免疫平衡與過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是并不能充分解釋過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病機(jī)制。有學(xué)者認(rèn)為，過(guò)敏原能夠?qū)D4+的Th細(xì)胞激活并分化成為不同的T細(xì)胞亞群，在過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，Th9細(xì)胞是近年新發(fā)現(xiàn)的一種Th細(xì)胞亞群，許多專家學(xué)者開始致力于研究Th9細(xì)胞與過(guò)敏性鼻炎發(fā)病的相關(guān)性[11]。IL-9主要由Th9細(xì)胞分泌產(chǎn)生，Th9細(xì)胞及其分泌的IL-9與自身免疫性腦脊髓炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。IL-9能夠激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)通路，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及Th17細(xì)胞分泌，若阻斷IL-9信號(hào)通路，會(huì)使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能下降[13-14]。本研究結(jié)果顯示，隨著過(guò)敏性鼻炎患者病情嚴(yán)重程度的發(fā)展，其Th9細(xì)胞比例及血清IL-9水平亦隨之升高，說(shuō)明Th9細(xì)胞比例及血清IL-9水平與過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。

PU.1是E26轉(zhuǎn)錄因子家族的主要成員，是Th9細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子。有研究顯示，PU.1能夠使Th9細(xì)胞表型增強(qiáng)[15]。除PU.1之外，IRF4也是Th9細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th9細(xì)胞分化以及功能維持方面起到關(guān)鍵作用[16]。本研究結(jié)果顯示，隨著過(guò)敏性鼻炎患者病情嚴(yán)重程度的發(fā)展，其PU.1 mRNA與IRF4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平亦隨之升高，說(shuō)明PU.1 mRNA、IRF4 mRNA與過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。

IL-4、TGF-β1也是Th9細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，與Th9細(xì)胞、IL-9水平變化密切相關(guān)[17]。研究表明，IL-4在過(guò)敏性鼻炎患者血清中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，其水平變化與過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。TGF-β1是一種重要的促纖維化生長(zhǎng)因子，與過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示，隨著過(guò)敏性鼻炎患者病情嚴(yán)重程度的發(fā)展，其血清IL-4、TGF-β1水平亦隨之升高，說(shuō)明血清IL-4、TGF-β1水平與過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。本研究多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、IRF4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均是過(guò)敏性鼻炎嚴(yán)重程度的影響因素(均P<0.05)。

綜上所述，隨著過(guò)敏性鼻炎病情嚴(yán)重程度的發(fā)展，患者Th9細(xì)胞比例、PU.1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、IRF4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平隨之上升，且IL-9、PU.1 mRNA、IRF4 mRNA、IL-4、TGF-β1均是過(guò)敏性鼻炎嚴(yán)重程度的影響因素。