藍隱藻PC645的存在狀態(tài)及其聚集態(tài)復合物的分離

王玉璇,李 琴,王 靜,張 昆,陳 敏,任慧慧,郭志強

(煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264005)

隱藻(cryptophytes)是一類單細胞光合藻類[1],其光合色素除了普遍存在于光合放氧生物中的葉綠素(chlorophyll, Chl)a以及雜色植物特有的Chl c之外,部分種屬中還發(fā)現(xiàn)存在藻膽蛋白,表明此類隱藻在進化上與含有藻膽蛋白為特征的紅、藍藻有著特殊聯(lián)系[2]。目前認為,隱藻是以紅藻和一種未知的宿主為前體,經(jīng)二次內(nèi)共生后產(chǎn)生的次級真核自養(yǎng)生物[3-5],其藻膽蛋白的β亞基來源于紅藻,但其α亞基的進化來源至今不明[6-7],是極為特殊的一類藻膽蛋白類型。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的隱藻藻膽蛋白有8種[8-9],但與紅、藍藻中存在的藻膽蛋白不同:一種隱藻中只含有一種藻膽蛋白,或藻紅蛋白(phycoerythrin,PE) 或藻藍蛋白(phycocyanin,PC),不含別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)[10];隱藻的藻膽蛋白不構成藻膽體樣的組裝結構;且其基本構成單元為異二聚體(α1β)(α2β),而非紅、藍藻藻膽蛋白的三聚體或六聚體;最為特殊的是,隱藻藻膽蛋白的存在位置不是貼附在葉綠體類囊體膜的外表面,而是存在于類囊體膜腔內(nèi)部[11]。至于其在膜腔中的存在狀態(tài),目前眾說紛紜。有報道認為是緊密結合于類囊體膜的內(nèi)表面[12];有的認為組裝成棒狀結構橫跨類囊體腔,兩端與膜組分相接觸[13];或一部分結合于膜表面,一部分散布于膜腔中[12,14]。最新的隱藻光合系統(tǒng)結構模型顯示,隱藻藻膽蛋白是以游離的方式密集填充于類囊體膜腔[15],認為隱藻藻膽蛋白的異二聚體是穩(wěn)定的、唯一的存在狀態(tài),不形成更高級的聚合形式,與膜上的Chl-蛋白復合物之間也沒有傾向性的結合關系[16-17]。但在實驗室的前期工作中,我們曾在充分洗滌后的類囊體膜上觀察到藻藍蛋白的存在[18],并分離到PC-Chl a/c-蛋白復合物[19],早期也有分離到與膜緊密結合的PE-Chl-蛋白復合物的報道[14],此外,還發(fā)現(xiàn)藍隱藻的藻膽蛋白PC645在溶液中的存在狀態(tài)并非均一的(結果未報道)。顯然,隱藻藻膽蛋白在類囊體膜腔中的存在狀態(tài)、自我組裝形式以及與膜的結合關系,都還有待于更多的實驗證據(jù)。本研究以含有藻藍蛋白的藍隱藻為材料,從未處理的細胞破碎液中,分離PC645及其可能存在的聚合或結合形式,分析、比較其聚合狀態(tài)與分離條件的關系,進而探究隱藻藻蛋白的天然存在形態(tài),為后續(xù)結構及功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同存在形式的PC645的分離

藍隱藻(Chroomonasplacoidea)的培養(yǎng)、收集和細胞破碎條件參照前期文獻[20],新鮮藻液破碎后,以50 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽(PBS)緩沖液(K2HPO4·3H2O 、NaH2PO4·2H2O)配制的蔗糖溶液進行密度梯度離心分離,采用的不連續(xù)梯度從上至下設計為:0.4 mol/L 1.0 mL、0.5 mol/L 2.0 mL、0.6 mol/L 1.0 mL、0.8 mol/L 1.0 mL、1.0 mol/L 1.0 mL、1.5 mol/L 4.0 mL,每管上樣量為2.0 mL。在25 ℃,30 000 r/min (BECKMAN Optima LXP制備型超速離心機,SW 41 Ti Rotor)的條件下分別離心2、4、6、8、12、22 h后,離心管取出拍照。

1.2 PC645的分離和純化

參照文獻[21]分離純化PC645,利用TU-1900紫外-可見分光光度計測定光吸收值,收集A645/A280≥7的PC645洗脫成分。

1.3 藻藍蛋白大分子復合的相對定量分析

取純化后(A645/A280≥7)的藻藍蛋白,采用pH 7.0、50 mmol/L的PBS緩沖液調整濃度至A645=5.0,經(jīng)660倍稀釋后,使其在580 nm激發(fā)光下的660 nm發(fā)射峰的相對熒光強度小于1000(落在BandⅡ藻藍蛋白相對熒光強度范圍內(nèi)),將此稀釋度的純藻藍蛋白PC645的相對濃度作為1.0,再將其進一步稀釋為原來0.75,0.56,0.42,0.32,0.24,0.18倍,以相對濃度(相對稀釋度)為橫坐標,660 nm相對熒光發(fā)射強度為縱坐標做標準曲線,分析相對熒光強度與PC645相對含量的線性關系。

1.4 pH對藻藍蛋白復合物的影響

1.4.1 破藻時PBS緩沖液pH對藻藍蛋白復合物含量的影響 分別在pH 4.92、5.91、6.47、6.98、8.04、8.67的66.7 mmol/L的PBS緩沖條件下破碎藻體細胞藻,破碎液均以pH 7.0,濃度為300 mmol/L 的PBS緩沖液配制的蔗糖溶液進行蔗糖密度梯度離心(梯度分布同1.1)6 h,每管上樣量為2.0 mL。離心管取出拍照。

1.4.2 PBS緩沖液的pH對分離條件的影響 分別使用pH為4.92、5.91、6.47、6.98、8.04、8.67的66.7 mmol/L的PBS緩沖液配制蔗糖梯度溶液,均使用pH 6.98、66.7 mmol/L的PBS緩沖液配制蔗糖密度梯度(梯度分布同上), 每管上樣量為2.0 mL。超速離心6 h后取出離心管拍照。

1.5 磷酸鹽緩沖液濃度對藻藍蛋白復合物的影響

1.5.1 破藻時PBS緩沖液的濃度對藻藍蛋白復合物含量的影響 分別采用50、100、200、300、400、500 mmol/L的pH 7.0的PBS緩沖條件下破藻,以300 mmol/L的pH 7.0的PBS緩沖液配制蔗糖溶液(梯度分布同1.1),每管上樣量為2.0 mL。超速離心6 h后取出離心管拍照。

1.5.2 PBS緩沖鹽的濃度對藻藍蛋白復合物分離條件的影響 采用50 mmol/L、pH 7.0的PBS緩沖液破藻,分別使用50、100、200、300、400、500 mmol/L的pH 7.0的PBS緩沖液配置蔗糖溶液(梯度分布同1.1),每管上樣量為2.0 mL。超速離心6 h后取出拍照。

1.6 光譜測定

將梯度離心后得到的各個條帶分別取出,經(jīng)50 mmol/L、pH 7.0的PBS緩沖液同倍數(shù)稀釋后,采用LS55熒光分光光度計測定室溫熒光光譜;TU-1900紫外-可見分光光度計測定吸收光譜。

2 實驗結果

2.1 離心時間對藻藍蛋白復合物分離的影響

由于采用速度離心法時,在其他條件一致的情況下,條帶所處的具體梯度位置完全取決于離心時間。因此實驗首先摸索了離心時間對分離效果的影響。壓力破碎后的藍隱藻細胞破碎液經(jīng)過6 h以上的蔗糖密度梯度超離心后均可觀察到3個條帶,以離心22 h所得條帶最為集中,且條帶之間界限清晰(圖1),從上至下依次稱為BandⅠ、Ⅱ、Ⅲ。藍色的BandⅠ除非離心22 h,否則通常位于0.4 mol/L蔗糖密度帶,呈現(xiàn)出582 nm、625 nm和645 nm三個典型的PC645吸收峰和肩峰,以及370 nm左右的吡咯結構的吸收峰(圖2);給予580 nm(對應藻藍蛋白主要吸收區(qū))激發(fā)光時產(chǎn)生660 nm PC645特征熒光發(fā)射峰。因此該條帶應該是主要以小分子質量異二聚體形式存在PC645蛋白條帶。當離心22 h,墨綠色的BandⅡ可遷移到1.0～1.5 mol/L的蔗糖密度帶之間,其余離心時間下則主要分布于0.8～1.5 mol/L的蔗糖區(qū)域。其吸收光譜中的428 nm及677 nm吸收主峰來自Chl a;464 nm峰則源于Chl c;490～495 nm峰為類胡蘿卜素的吸收,說明該條帶中含有大量的葉綠素-蛋白復合物;而583 nm和626 nm的起伏吸收峰則表明條帶中含有藻藍蛋白。分別給予對應于Chl a和c的435 nm和460 nm的激發(fā)光,均產(chǎn)生685 nm左右屬于Chl a的熒光發(fā)射,說明葉綠素之間保持著良好的能量傳遞關系;當給予580 nm的激發(fā)光時,主要產(chǎn)生660～662 nm屬于藻藍蛋白的特征熒光發(fā)射;同時在發(fā)射波長為660 nm的熒光激發(fā)光譜中(圖4),激發(fā)貢獻主要來源于580 nm和625 nm的藻藍蛋白,而430～440 nm屬于Ch la和460 nm屬于Chl c的熒光貢獻很微弱,顯然660 nm熒光主要產(chǎn)自非結合狀態(tài)的藻藍蛋白,表明此條帶存在相當比例的游離的藻藍蛋白組分。由于該組分離心遷移位置明顯低于異二聚體形式為主的BandⅠ,因此應為聚合的大分子PC645復合物。此外,該條帶在580 nm激發(fā)光下同時也表現(xiàn)出685 nm附近的Chl a的發(fā)射肩峰,在發(fā)射波長為700 nm的熒光激發(fā)光譜中可以看出Chl a、Chl c、PC645均對700 nm的熒光發(fā)射有貢獻,顯示PC645吸收的光能還有一定比例傳遞給了Chl a,說明此條帶中還有一部分PC645是以結合態(tài)存在的,且與Chl a之間依然保持能量傳遞關系。上述結果表明BandⅡ可能是藻藍蛋白-Chl a/c-蛋白復合物與大分子藻藍蛋白復合物的混合條帶。Band Ⅲ則位于離心管底部的1.5 mol/L蔗糖密度帶,為帶有墨綠色沉淀的淺綠色條帶,光譜中屬于Chl a、Chl c和PC645的吸收峰均有出現(xiàn),且分子質量很大,主要是細胞器、類囊體膜碎片等大顆粒物質。

圖1 藍隱藻細胞破碎液的蔗糖密度梯度離心

圖2 超離心分離各條帶吸收光譜

圖3 BandⅡ熒光發(fā)射光譜

圖4 BandⅡ熒光激發(fā)光譜

2.2 藻藍蛋白及復合物相對定量方法的建立

以往的文獻對大顆粒聚合態(tài)隱藻藻膽蛋白的形成沒有報道,為了更好地檢測BandⅡ中藻藍蛋白復合物的含量變化,我們嘗試建立以580 nm光激發(fā),以PC645的660 nm特征熒光為指標,觀測游離存在的PC645復合物相對含量的檢測方法。藻膽蛋白具有很高的熒光光量子產(chǎn)率,微量時即可產(chǎn)生明顯的熒光信號;而且藻膽蛋白色基與蛋白質是共價結合的,不會在分離過程中因色基脫落造成誤判。

純化后的PC645經(jīng)梯度稀釋,在與BandⅡ中藻藍蛋白相近的濃度范圍附近,在580 nm的激發(fā)光下,其660 nm熒光與A645(濃度)之間呈現(xiàn)良好的線性關系,相關系數(shù)0.999 8(圖5)。BandⅡ中的Chl a 和 Chl c對580 nm激發(fā)光會產(chǎn)生微弱的吸收,但兩者發(fā)射的熒光主要分別在680～685以及630～640 nm;而結合態(tài)的PC645將激發(fā)能傳給了Chl a,并發(fā)射屬于Chl a的685 nm熒光。因此660 nm相對熒光強度的大小反映的是BandⅡ中游離存在的藻藍蛋白復合物的相對含量的高低。

圖5 純化的PC645的 660 nm熒光標準曲線

2.3 pH對藻藍蛋白復合物的影響

2.3.1 破藻時PBS緩沖液pH對PC645復合物含量的影響 圖6顯示,藻細胞破碎時緩沖液pH變化對BandⅠ和Band Ⅲ的影響不明顯,但BandⅡ的遷移位置和顏色發(fā)生了變化。pH越低,BandⅡ越集中于高密度區(qū)。pH為4.92時,BandⅡ位于1.5 mol/L蔗糖密度梯度的上部;pH為8.67時BandⅡ已移動到0.8 mol/L的蔗糖密度下部。說明pH降低,PC645復合物的分子密度或分子質量呈增加的趨勢。熒光光譜分析顯示(圖7),遷移位置不同的Band Ⅱ 的光譜性質無明顯變化,只影響到相對強度。圖8的趨勢分析表明,pH較低時,BandⅡ相對熒光強度較高,相應的條帶中PC645復合物的含量更高,尤以pH 4.92時復合物熒光最強、含量最高。但是由于PBS緩沖液配制條件限制,無法研究更低pH 破藻對藻藍蛋白復合物形成的影響。pH 6.5～7.0的中性條件下BandⅡ相對熒光強度有所起伏,pH 7.5以上的堿性條件下呈現(xiàn)出大幅度持續(xù)降低趨勢。上述結果說明,酸性條件下有利于PC645復合物的聚合和穩(wěn)定,此時條帶中復合物不僅分子質量更大,相對熒光強度也更高,說明其活性保持的更好,顯示聚合態(tài)的PC645很可能是其傳能的活躍狀態(tài)。

圖6 破藻時pH變化對PC645復合物分離的影響

圖7 破藻時pH對PC645復合物熒光發(fā)射光譜的影響

圖8 破藻時pH變化對PC645復合物660 nm熒光峰值的影響趨勢

2.3.2 離心分離時PBS緩沖液pH變化對PC645復合物含量的影響 離心分離時PBS緩沖液的pH變化同樣影響PC645復合物所在的BandⅡ的遷移率(圖9)。

圖9 離心分離時不同pH對PC645復合物的影響

由圖9可見,隨著pH的增加,BandⅡ從1.5 mol/L的蔗糖密度區(qū)擴散進入1.0 mol/L甚至0.8 mol/L蔗糖梯度區(qū),表明條帶中成分在堿性條件下趨于解離,分子質量或密度降低。離心分離時不同pH條件下條帶的光譜性質相似,但相對熒光強度發(fā)生變化(圖10)。pH 7以下時,熒光發(fā)射峰位穩(wěn)定于660～662 nm,光譜形態(tài)基本不變;但pH 8以上時,光譜形態(tài)發(fā)生明顯變化,熒光發(fā)射強度明顯下降,提示藻藍蛋白復合物不僅聚合程度降低,甚至亞基也有變性的趨勢。中性或微堿性條件時(pH 6.5～7.0),熒光強度有一個隨pH變化的平臺期,而pH 4.92 ～ 6.5范圍內(nèi),復合物光譜穩(wěn)定,峰值也漸高(圖11)。再次說明,較低的pH有利于藻藍蛋白復合物的形成與穩(wěn)定。在此實驗條件下,pH 4.92為最佳分離條件。

圖10 離心分離時pH對PC645復合物熒光發(fā)射光譜的影響

圖11 離心分離時pH對PC645復合物 660 nm熒光峰值的影響趨勢

2.4 緩沖液磷酸鹽濃度變化對藻藍蛋白復合含量的影響

2.4.1 破藻時PBS緩沖液濃度對藻藍蛋白復合物含量的影響 磷酸鹽是藻膽蛋白分離和保存常用的緩沖鹽,紅、藍藻的藻膽體在磷酸鹽濃度過低會出現(xiàn)解離。如圖12的結果顯示,破藻時磷酸鹽的濃度在50～500 mol/L范圍內(nèi),藻體破碎液離心后產(chǎn)生的各條帶顏色、相對遷移位置基本不變。鹽濃度達到500 mmol/L時,BandⅠ的遷移位置向下蔓延,說明有一定比例的藻藍蛋白異二聚體發(fā)生一定程度的聚合,出現(xiàn)分子質量或密度介于BandⅠ和Band Ⅱ之間的大顆粒成分,值得進一步觀察。由圖13看出,6個PBS濃度的破藻條件下熒光峰形相近,在580 nm激發(fā)光下主要發(fā)射660 nm的熒光,說明存在相當數(shù)量的游離大分子藻藍蛋白復合物;而在685～687 nm左右的肩峰,應該是結合態(tài)PC645將能量傳遞給了Chl a或者葉綠素在580 nm處的弱吸收導致。圖14的660 nm熒光峰值變化趨勢顯示,破藻時PBS濃度為50 mmol/L時,BandⅡ的相對熒光強度最高,可近似認為游離藻藍蛋白復合物含量最高;隨著鹽濃度的升高,熒光強度反而降低,達到500 mmol/L時又呈現(xiàn)增高的反彈趨勢。因此,在此實驗條件下,破藻時50 mmol/L的PBS,最適合BandⅡ中游離藻藍蛋白復合物的分離。

圖12 破藻時PBS濃度對PC645復合物分離的影響

圖13 破藻時PBS濃度對PC645復合物熒光發(fā)射光譜的影響

圖14 破藻時PBS濃度對PC645復合物660 nm熒光峰值的影響趨勢

2.4.2 磷酸鹽緩沖液的濃度對藻藍蛋白復合物含量的影響 離心分離時鹽濃度梯度使原有的蔗糖梯度密度變化,因此條帶的所處的位置普遍發(fā)生變化。低鹽濃度時,BandⅡ遷移較快;而鹽濃度升高到400 mmol/L以上時,BandⅡ甚至仍滯留在0.6 mol/L蔗糖梯度區(qū)(圖15)。但分離條帶的數(shù)量、顏色和條帶之間的相對位置未發(fā)生變化,不影響富含PC645復合物的BandⅡ的觀察和熒光分析。如圖16和17所示,在破碎藻細胞時采用50 mmol/LPBS條件下所得的藻液,其Band Ⅱ在580 nm激發(fā)光下產(chǎn)生的660 nm特征熒光峰值隨著PBS濃度的增加而增大,之后又呈下降的趨勢,分離介質中PBS濃度為300 mmol/L時相對熒光強度最高。在此分離條件下,似乎過高或過低的離子強度都不利于復合物的聚合。

圖15 離心分離時PBS濃度對PC645復合物分離的影響

圖16 離心分離時不同PBS濃度對PC645復合物熒光發(fā)射譜的影響

圖17 離心分離時不同PBS濃度對PC645復合物660 nm熒光峰值的影響趨勢

3 討 論

隱藻藻膽蛋白作為進化上比較特殊的一類藻膽蛋白,與已被人熟知的紅、藍藻中的藻膽蛋白相比,存在許多不同或特異之處,但目前對其了解遠不及紅、藍藻中的藻膽蛋白透徹。并且現(xiàn)有對隱藻藻膽蛋白的報道又大多集中于游離的異二聚體或者更小的單體[22-24],對于異二聚體之間的相互作用,以及作為隱藻主要的捕光復合物與類囊體膜上Chl-蛋白之間的接觸機制還存在爭議。VESK等[25]采用了包括生化分離、固定化染色及免疫細胞化學等多種方法試圖對PE545進行定位,但他們給出的結論是上述方法均無法確定PE545在膜腔中的狀態(tài)。為此,實驗采用物理性壓力破碎處于對數(shù)生長期的藍隱藻細胞后,將未經(jīng)處理的細胞破碎液進行溫和的蔗糖密度梯度離心,以期得到天然狀態(tài)的不同PC645形式,并了解不同形式的性質、功能和定位。

據(jù)報道,隱藻藻膽蛋白與Chl a之間的能量傳遞效率很高,可達98%～99%[16],但在580 nm激發(fā)光下,活體藍隱藻細胞中以及分離的類囊體膜上通常都有超過50%的激發(fā)能以660 ～665 nm熒光被發(fā)散掉,而沒有傳遞給位于類囊體膜上的反應中心[18],說明活體細胞中發(fā)射這部分剩余熒光的PC645應該是在功能上屬于冗余或備用的捕光復合物部分。實驗破碎后的藍隱藻細胞液經(jīng)蔗糖密度梯度離心后,可得到大量游離的PC645異二聚體(BandⅠ),顯然,在實驗所用藍隱藻中,異二聚體形式應是PC645存在形式中最豐富的,而且天然地以游離狀態(tài)存在于類囊體膜腔中。

DOUST等[26]在超高分辨率的晶體衍射和超快光譜分析基礎上,采用量子化學計算方法計算得出的結論認為,隱藻藻紅蛋白PE545異二聚體之間以及與膜上Chl a之間,在間距小于5 nm時即可完成激發(fā)能的傳遞,而無需直接的分子間接觸。只是若完全以此方式進行能量傳遞,效率比活體細胞中低的多,說明隱藻中藻膽蛋白參與的激發(fā)能的傳遞方式應該不是單一的。本實驗在高密度蔗糖梯度區(qū)發(fā)現(xiàn)有PC-Chl-蛋白復合物以及大分子PC645復合物的混合條帶。經(jīng)吸收和熒光光譜分析,其中結合態(tài)的PC645與葉綠素之間仍保持著高效能量傳遞關系,結果直接表明PC645存在有膜結合的形式,并且從功能上處于活躍的能量傳遞狀態(tài)。

大分子游離隱藻藍蛋白聚合顆粒的發(fā)現(xiàn),說明隱藻藻膽蛋白在類囊體膜中的天然存在狀態(tài)也并非單一的,一部分游離的PC645可在一定條件下自發(fā)聚合形成更高級的自組裝形式。以580 nm激發(fā)光下660 nm熒光為監(jiān)測指標,通過改變藻體在壓力破碎和蔗糖密度梯度離心分離時磷酸鹽的濃度和pH,了解聚合形態(tài)的PC645形成與分離時鹽濃度及pH的關系。發(fā)現(xiàn)該條帶中大分子藻藍蛋白復合物在破藻緩沖液中磷酸鹽濃度為50 mmol/L、pH 4.92,蔗糖密度梯度溶劑磷酸鹽緩沖液濃度為300 mmol/L、pH 4.92時含量最高。李文軍等[27]曾報道,隱藻PC645在pH 3～10 范圍內(nèi)基本保持穩(wěn)定,尤其是pH 3.5～7.0的酸性范圍內(nèi),結構和能量傳遞功能最為穩(wěn)定。實驗結果顯示,一定濃度的磷酸鹽和pH小于6.5的酸性條件有利于藻藍蛋白復合物的形成和穩(wěn)定,而在功能穩(wěn)定狀態(tài)下聚合態(tài)PC645含量更高的實驗結果,說明聚合形式的PC645很可能是能量傳遞的活性形式之一。

上述實驗結果進一步證實和完善了本課題組之前提出的隱藻藻膽蛋白在葉綠體中可能的存在動態(tài)結合模型[18],即藻膽蛋白在類囊體腔中的存在是非均一的,與膜的結合狀態(tài)也可能是動態(tài)的,一部分為膜結合型,另一部分為游離狀態(tài)。處于結合狀態(tài)的藻膽蛋白直接參與光能向反應中心的傳遞,而游離狀態(tài)的藻膽蛋白可以不同形態(tài)存在,一部分對于捕光功能來說可能暫時是冗余的,以某種方式中斷了與光合系統(tǒng)之間的能量傳遞關系,而當需要的時候,游離的藻膽蛋白還可與類囊體膜內(nèi)表面重新結合或聚集。近年來被引進的二維光子反射光譜技術研究結果也顯示[22,28-29],隱藻藻膽蛋白的能量傳遞十分高效,可能是多路徑的,并且存在大量色基共同參與的相干能量傳遞方式;MIRKOVIC 等[30]助光漂白熒光恢復(FRAP)和共聚焦顯微方法也發(fā)現(xiàn)隱藻中大部分(73%)的天線蛋白在類囊體腔中能夠以與藻膽體的擴散能力相接近的速度在膜腔中有限遷移,原因可能與PE545與膜相互作用或者蛋白聚合有關。實驗結果將為深入了解隱藻藻膽蛋白的結構、組裝和功能提供重要依據(jù)。