靈芝三萜通過Wnt信號通路對膠質(zhì)瘤細胞侵襲和遷移的影響*

王炳清， 馬慶波， 劉敬博， 高俊波

(北大醫(yī)療魯中醫(yī)院 神經(jīng)外科， 山東 淄博 255400)

膠質(zhì)瘤是一種常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病后患者表現(xiàn)出惡心嘔吐、頭痛、視覺模糊、癲癇等癥狀，嚴重時出現(xiàn)視覺喪失、肢體疼痛或麻木、肌力弱、運動與感覺障礙，臨床多給予患者手術(shù)聯(lián)合放化療，該病很難根治，術(shù)后復發(fā)率也較高[1-2]，預后不佳，因此探討其發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子生物學機制和基因表達調(diào)節(jié)規(guī)律對于改善患者預后有著重要的意義[3-4]。Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路(Wnt/β-catenin)是生物進化中調(diào)控細胞增殖、生長和凋亡的重要通路，其異常激活與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均密切相關(guān)[5]，推測干預該通路可幫助治療膠質(zhì)瘤[6]。頭痛、頭風、真頭痛、厥逆等癥狀，中醫(yī)認為屬于外感六邪或內(nèi)傷七情而致機體氣血陰陽失衡，郁結(jié)于腦內(nèi)所致[7-8]；而中藥材靈芝性溫、味甘，具有補中益氣、扶正固本、滋補強壯的功效[9]，因此本文選取靈芝的主要成分之一靈芝三萜作用于人膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞，觀察對細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響，分析靈芝三萜通過Wnt信號通路對膠質(zhì)瘤細胞侵襲和遷移的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 由中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫內(nèi)購入人膠質(zhì)瘤細胞株U251。

1.1.2主要儀器及試劑 (dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜及Transwell小室購自美國Thermo Fisher公司，靈芝三萜(99%純度)購自杭州甫洛生物科技有限公司，Wnt/β-catenin通路的檢測試劑盒及相關(guān)試劑購自美國Sigma公司，兔抗人β-catenin多克隆體、兔抗人p-GSK-3β多克隆體購自英國Abcam公司；流式細胞儀購自美國BD公司，CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，HBS-1096B酶標儀購自南京德鐵試驗設(shè)備公司。

1.2 方法

1.2.1分組及細胞培養(yǎng) 本研究將U251細胞分為4組：空白對照組未進行藥物處理，低、中、高劑量組分別給予10、50 及100 mg/L的靈芝三萜處理。將人膠質(zhì)瘤U251細胞復蘇后接種于DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，內(nèi)含10%FBS，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液1次，細胞密度達85%時使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期期U251細胞接種至6孔板內(nèi)，密度為1×109個/L，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜，細胞貼壁后，采用10、50 及100 mg/L的靈芝三萜及等量的PBS分別處理U251細胞，置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2CCK8實驗檢測細胞增殖 設(shè)置3個復孔，于藥物處理后培養(yǎng)24、48及72 h時，加入10 μL CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)4 h。使用酶標儀讀取波長490 nm處的吸光度(OD值)，取平均值，該OD值代表細胞的增殖能力。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞侵襲 藥物處理后各組U251細胞均使用胰酶消化，使用改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液懸浮并調(diào)整細胞濃度為1×108個/L，Transwell小室上室加100 μL細胞懸液，將下室內(nèi)加入DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS)500 μL，設(shè)置3個平行復孔，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h。取出小室，PBS洗滌2次，多聚甲醛(4%)固定30 min，1%結(jié)晶染色10 min，PBS洗滌并晾干，隨機選取3個視野在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計細胞侵襲數(shù)，實驗重復3次，取平均值進行計算。

1.2.4劃痕實驗檢測細胞遷移 藥物處理后的貼壁細胞以每孔1×106個細胞在6孔板內(nèi)接種，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，細胞貼壁單層生長時，使用無菌移液槍對6孔板表面垂直直線劃痕，PBS洗去脫落細胞，更換培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，每組均設(shè)置3個復孔，使用顯微鏡觀察劃痕距離并計算細胞遷移率，實驗重復3次，取平均值進行計算。

1.2.5流式細胞儀技術(shù)檢測細胞凋亡率 將藥物處理后5×105個對數(shù)生長期的U251細胞接種在75 mL的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入10 mL F12培養(yǎng)液，干預24 h后，收集懸液及貼壁細胞，加入Annexin V-FITC488和PI溶液，室溫下避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測3次，取平均值。

1.2.6Western blot檢測β-catenin、p-GSK-3β蛋白表達 取1.2.1中的細胞提取蛋白，加適量放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液冰上裂解細胞(30 min)，置于4 ℃環(huán)境中以12 000 r/min離心30 min，吸取上清液。取等量總蛋白上樣，12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(dodecyl sulfate,sodium salt -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳，直至電泳道膠的底端，轉(zhuǎn)膜，無蛋白快速封閉液封閉20 min，加一抗(1 ∶10 000)、二抗(1 ∶10 000)，以β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件分析蛋白表達情況，實驗重復3次，取平均值進行計算。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 對細胞增殖的影響

結(jié)果顯示，藥物作用各時點，對照組的OD值高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高藥物作用各時點的OD值均逐漸降低，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜各組的OD值均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 靈芝三萜對U251細胞增殖的影響

2.2 對細胞侵襲的影響

結(jié)果顯示，藥物作用各時點，對照組的侵襲細胞數(shù)均多于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；靈芝三萜作用24、48及72 h時,隨著靈芝三萜濃度的升高侵襲細胞數(shù)均逐漸減少，但隨著作用時間的延長、不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的侵襲細胞數(shù)均增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 靈芝三萜對U251細胞侵襲的影響

2.3 對細胞遷移的影響

結(jié)果顯示，藥物作用各時點，對照組的細胞遷移率均高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時點的細胞遷移率均逐漸降低，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的遷移率均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 靈芝三萜對U251細胞遷移率的影響

2.4 對細胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，對照組細胞各時點的凋亡率均高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時點的細胞凋亡率均逐漸降低，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 靈芝三萜對U251細胞凋亡的影響

2.5 β-catenin蛋白表達的變化

結(jié)果顯示，對照組藥物各作用時間的β-catenin蛋白表達均高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時點的β-catenin蛋白表達均逐漸升高，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的β-catenin蛋白表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表5。

表5 靈芝三萜對U251中β-catenin蛋白表達的影響

圖1 各組人膠質(zhì)瘤細胞株U251中β-catenin蛋白表達(Western blot)

2.6 p-GSK-3β蛋白表達的變化

結(jié)果顯示，對照組藥物作用各時間點的p-GSK-3β蛋白表達均高于各靈芝三萜組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著靈芝三萜濃度的升高各作用時點的p-GSK-3β蛋白表達均逐漸升高，但隨著作用時間的延長不同濃度靈芝三萜轉(zhuǎn)染下的p-GSK-3β蛋白表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表6。

表6 靈芝三萜對U251中p-GSK-3β蛋白表達的影響

圖2 各組人膠質(zhì)瘤細胞株U251中p-GSK-3β蛋白表達(Western blot)

3 討論

臨床中已有較多研究證實Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均有重要作用，β-catenin在細胞核、細胞膜、細胞質(zhì)內(nèi)均存在，是Wnt信號通路中的關(guān)鍵信號樞紐[10]。正常狀態(tài)下機體內(nèi)的Wnt信號通路未激活，細胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin與GSK-3β相結(jié)合，隨之被相應受體磷酸化，并經(jīng)泛素酶降解，因此正常狀態(tài)下胞質(zhì)β-catenin水平始終較低。而當Wnt信號通路被異常激活時，β-catenin蛋白則因無法被降解而大量聚集在胞質(zhì)內(nèi)，并遷移至細胞核中，形成轉(zhuǎn)錄復合物，促使該通路下游靶基因轉(zhuǎn)錄，導致細胞生長[11-13]。因此當Wnt信號通路受到外界刺激異常激活時，β-catenin發(fā)生突變會造成細胞周期異常變化，細胞增殖失控，凋亡過程抑制，誘發(fā)腫瘤[14]。而腫瘤發(fā)生的實質(zhì)則是癌細胞的持續(xù)分裂和增殖，因此通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡，對于改善癌癥患者預后有重要意義[15]。

近年來中西醫(yī)結(jié)合治療膠質(zhì)瘤取得了一定的進展，其中靈芝作為珍貴的中藥材也廣泛用于對癌癥患者的臨床治療中，作為抗腫瘤輔助藥物，靈芝不僅能夠增強機體的免疫力，對人體的毒副作用也較小[16-17]。但隨著各項研究的不斷深入，雖有研究已經(jīng)明確靈芝對癌癥患者具有一定的治療作用，但尚未明確靈芝在癌癥治療中的具體作用機制，尚未清楚其是通過哪一個方面發(fā)揮的作用[18]?？紤]到Wnt/β-catenin信號通路對癌細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等過程的影響[19]，本研究選取靈芝的主要成分之一靈芝三萜作用于人膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞，觀察不同劑量和不同作用時間U251細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡的變化，分析靈芝三萜通過Wnt信號通路對膠質(zhì)瘤細胞侵襲和遷移的影響，以期能為今后臨床治療提供指導。

靈芝三萜具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、增強免疫力等作用，是靈芝提取物的主要活性成分，已知其在細胞的增殖、鈣信號轉(zhuǎn)導和氧化應激等生物過程中均有重要作用[20-21]。本文結(jié)果顯示，使用靈芝三萜培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤U251細胞株增殖、侵襲和遷移能力減弱，凋亡率升高，隨著靈芝三萜濃度的升高，這種作用愈發(fā)明顯，且該作用與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)。既往研究中發(fā)現(xiàn)含羥基的靈芝三萜物質(zhì)靈芝酸A、H、F能夠?qū)θ橄侔┘毎纳L和侵襲產(chǎn)生抑制，這與本研究的結(jié)果相似。分析靈芝三萜的具體作用機制，發(fā)現(xiàn)靈芝三萜能夠?qū)C體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用，進而影響中性粒細胞釋放炎癥介質(zhì)，進而阻止了Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，對腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡過程產(chǎn)生了影響[22]。同時靈芝三萜提高了機體的免疫活性，促進了T淋巴細胞活化，增強了化療藥物的作用效果，增強藥物對腫瘤細胞的殺傷力，達到了較佳的臨床效果[23]。

β-catenin蛋白是與細胞骨架相互作用的多功能蛋白，可促進細胞分裂基因的啟動；GSK-3β可調(diào)控糖原合成酶活性，介導信號蛋白結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，可調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、存活和凋亡[24]。β-catenin、p-GSK-3β蛋白均為Wnt信號通路中的重要因子，本文中在靈芝三萜的作用下β-catenin、p-GSK-3β蛋白表達明顯降低，說明靈芝三萜對Wnt信號通路產(chǎn)生了影響，進而對腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡過程產(chǎn)生了影響。

綜上所述，靈芝三萜能夠通過Wnt信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡。