兩種兒童肺炎早期部分免疫指標(biāo)的變化及臨床價(jià)值*

卓佳佳， 蘇曉霽， 張晨宇， 張?jiān)姾? 朱麗娟

(安徽省兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 安徽 合肥 230001)

肺炎支原體是引起兒童呼吸道感染的病原體之一，除會(huì)引起上呼吸道感染外，還能引起間質(zhì)性肺炎，可占到非細(xì)菌性肺炎的1/3以上，其臨床表現(xiàn)和影像學(xué)所見都類似病毒性肺炎[1-2]；巨細(xì)胞病毒(HCMV)又稱為人皰疹病毒5型，其感染極為廣泛，也是兒童感染常見的病原體之一，臨床多見于肝炎和肺炎[3-4]。兩種病原體的感染都可以引起患者的免疫狀態(tài)失衡，造成病情的遷延或處于感染狀態(tài)[5-6]。肺炎支原體和HCMV引起的肺炎為住院兒童最常見的肺炎類型，許多文獻(xiàn)都探討了兩種病原體感染后患者免疫狀態(tài)的改變[7-12]，但較少關(guān)注感染早期的變化特點(diǎn)，查閱文獻(xiàn)未見兩種病原體感染肺炎患者免疫狀態(tài)比較的研究。為了解患兒感染兩種病原體后早期免疫功能的變化、及這種變化能否輔助兩種肺炎的鑒別診斷，本研究選取2019年1月—2020年12月住院的肺炎患兒160例(肺炎支原體肺炎129例、巨細(xì)胞病毒肺炎31例)，檢測其外周血中各類淋巴細(xì)胞以及血清免疫球蛋白，探討兩種病原體肺炎感染與機(jī)體免疫狀態(tài)的改變的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1一般資料 選取2019年1月—2020年12月收治的129例肺炎支原體肺炎患兒作為支原體組，男78例、女51例，年齡(3.01±2.79)歲；其中31例HCMV肺炎患兒作為病毒組，男20例、女11例，年齡(3.05±2.98)歲，2組患兒共160例作為研究組；肺炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[13-14]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、咳嗽、頭痛和咽喉痛等癥狀，病程<7 d；(2)影像學(xué)顯示肺部炎癥改變；(3)實(shí)驗(yàn)室在收集到的肺泡灌洗液中檢出肺炎支原體或HCMV核酸；(4)通過肺泡灌洗液細(xì)菌涂片及培養(yǎng)和血清呼吸道病原體抗體9聯(lián)檢等相關(guān)指標(biāo)，排除存在混合感染的可能。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病或全身感染等嚴(yán)重疾病;(2)近期使用抗生素或者激素;(3)存在免疫功能缺陷;(4)有家族性遺傳病。正常對照兒童50例作為對照組，為眼科住院病人，住院前期各項(xiàng)檢查已排除肺炎感染，其中男34例、女16例，年齡(3.54±3.31)歲。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn) (批準(zhǔn)文號2019-SR-196)，所有納入研究患者知情同意。

1.1.2儀器與試劑 BD公司FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀、ABI公司QuantStudio DX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、日立7600型全自動(dòng)生化分析儀，Beckman公司熒光標(biāo)記復(fù)合檢測試劑、湖南圣湘公司肺炎支原體核酸定量檢測試劑盒和HCMV核酸定量檢測試劑盒。

1.2 研究方法

1.2.1標(biāo)本收集 研究組(支原體組和病毒組)和對照組兒童入院時(shí)采集外周血標(biāo)本、研究組患兒同時(shí)采集肺泡灌洗液標(biāo)本，外周靜脈血采用EDTA-K2抗凝管和生化專用管保存，肺泡灌洗液標(biāo)本利用纖維支氣管鏡收集并注入無菌專用管。

1.2.2淋巴細(xì)胞亞群比例的檢測 取流式上樣離心管，加入混勻的100 μL抗凝全血和10 μL標(biāo)記熒光基團(tuán)的復(fù)合檢測試劑，混勻后37 ℃避光孵育20 min，加入500 μL溶血素，混勻后37 ℃避光孵育20 min、上機(jī)檢測。通過流式細(xì)胞儀檢測各種細(xì)胞表面的熒光信號，獲得表達(dá)CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16+CD56+、CD3-CD19+的各群細(xì)胞的比例。

1.2.3血清IgM、IgA、IgG濃度檢測 使用全自動(dòng)生化儀采用散射比濁法檢測血清IgM、IgA、IgG濃度，通過反應(yīng)體系的濁度，最終獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

1.2.4肺炎支原體和HCMV核酸檢測 取混勻的支氣管肺泡灌洗液1 mL加入1.5 mL規(guī)格的Epp管，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，加入100 μL核酸釋放液后混勻，室溫放置30 min后1 000 r/min離心5 min，將10 μL上清液加入至配制好的反應(yīng)體系中，放入PCR儀自動(dòng)運(yùn)行預(yù)先設(shè)置的反應(yīng)條件；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)計(jì)算獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到病原體核酸的拷貝數(shù)。對不同病原體的病例，按照檢出病原體拷貝數(shù)從低到高進(jìn)行順序排列，患兒分別根據(jù)肺炎支原體和HCMV拷貝數(shù)跨度的指數(shù)范圍平均分割，分為低、中、高拷貝3個(gè)病例組，選取低拷貝病例組和高拷貝病例組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。肺炎支原體高拷貝組核酸為107～109拷貝/mL、低拷貝組核酸為102～104拷貝/mL；HCMV高拷貝組核算為106～107拷貝/mL、低拷貝組核酸為102～103拷貝/mL。

1.3 觀察指標(biāo)

比較支原體組、病毒組和對照組兒童外周血中各類淋巴細(xì)胞的百分比和血清中IgM、IgA和IgG的濃度，比較肺炎支原體高拷貝組和低拷貝組、HCMV高拷貝組和低拷貝組外周血中各類淋巴細(xì)胞的百分比和血清中IgM、IgA和IgG的濃度，分析這些免疫指標(biāo)的變化及臨床價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同肺炎患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群比例和免疫球蛋白濃度

2.1.1支原體組與對照組 支原體組CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例高于對照組(t=5.06、4.83、12.41，P<0.05)，CD3-CD16+CD56+淋巴細(xì)胞比例低于對照組(t=-13.17，P<0.05)；兩組間CD3+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.53、-0.55，P>0.05)。見表1。支原體組的IgG和IgA濃度低于對照組(t=-7.79、-7.57，P<0.05)，IgM濃度高于對照組(t=3.54，P<0.05)。見表2。

2.1.2病毒組與對照組 病毒組CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例和CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例高于對照組(t=2.42、3.32，P<0.05)，CD3-CD16+CD56+淋巴細(xì)胞比例低于對照組(t=-9.30，P<0.05)；2組CD3+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.69、1.32、1.13，P>0.05)，見表1。病毒組的IgG濃度和IgA濃度低于對照組(t=-2.63、-12.10，P<0.05)；兩組間IgM濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.63，P>0.05)，見表2。

2.1.3支原體組與病毒組 支原體組CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例低于病毒組(t=-2.33，P=0.02<0.05)，兩組間CD3+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD3-CD16+CD56+淋巴細(xì)胞比例及CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.47、1.28、1.97、-0.26、1.65，P=0.64、0.20、0.05、0.79、0.10)，見表1；支原體組的IgA濃度和IgM濃度高于病毒組(t=6.37、2.42，P<0.001、P=0.02)，2組IgG濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.06，P=0.95>0.05)，見表2。

表1 支原體組和病毒組及對照組的淋巴細(xì)胞亞群比例和比值

表2 支原體組和病毒組及對照組的血清免疫球蛋白濃度

2.2 高拷貝組和低拷貝組外周血淋巴細(xì)胞亞群比例和免疫球蛋白濃度

2.2.1肺炎支原體 肺炎支原體高拷貝組的CD3-CD16+CD56+淋巴細(xì)胞比例高于低拷貝組(t=-2.19，P=0.03)；其余CD3+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、及CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例在兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.01、1.28、-1.03、1.48、0.96，P>0.05)，見表3。肺炎支原體高拷貝組免疫球蛋白IgA濃度和IgM濃度高于低拷貝組(t=-2.32、-2.97，P<0.05)，兩組IgG濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.21，P>0.05)，見表4。

2.2.2HCMV病毒 HCMV病毒高拷貝組的CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例高于低拷貝組(t=-2.52，P<0.05)，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值低于低拷貝組(t=2.44，P<0.05)；兩組CD3+淋巴細(xì)胞比例、CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例、CD3-CD16+CD56+淋巴細(xì)胞比例和CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.01、1.79、0.41、0.50，P>0.05)，見表3；兩組免疫球蛋白IgG濃度、IgA濃度和IgM濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.72、1.36、-0.36，P>0.05)。見表4。

表3 兩種肺炎不同拷貝組的淋巴細(xì)胞亞群比例和比值

表4 兩種肺炎不同拷貝組的血清免疫球蛋白濃度

3 討論

成熟淋巴細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞之一，可以分為：T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞三大群。T淋巴細(xì)胞是一群非常重要的淋巴細(xì)胞,是參與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)并主導(dǎo)調(diào)節(jié)的一群細(xì)胞，其中細(xì)胞表面表達(dá)簇分化抗原(CD分子)CD3+淋巴細(xì)胞是成熟T淋巴細(xì)胞，檢測其比例直接反映T淋巴細(xì)胞的成熟活化程度。成熟T淋巴細(xì)胞又可分為CD4+和CD8+兩個(gè)亞群：CD4+淋巴細(xì)胞被稱為輔助性淋巴細(xì)胞，可以誘導(dǎo)和增強(qiáng)其他免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答；CD8+淋巴細(xì)胞被稱為細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，可以調(diào)節(jié)和抑制對外界抗原的免疫反應(yīng)，消滅受感染的細(xì)胞。兩群細(xì)胞之間相互調(diào)節(jié)和限制達(dá)到免疫平衡，既可以清除有害物質(zhì)保護(hù)機(jī)體又可以避免過度免疫損傷機(jī)體。所以二者的比例也是反應(yīng)機(jī)體免疫功能變化的重要指標(biāo)。NK細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+)，又叫自然殺傷細(xì)胞，是一種非特異的殺傷細(xì)胞，可以殺傷腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞和寄生蟲等，是重要的細(xì)胞免疫細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)是一種體液免疫相關(guān)的細(xì)胞，在接受抗原刺激后可增殖分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞可分泌和合成大量包括IgG、IgA、IgM在內(nèi)的各類免疫球蛋白，臨床實(shí)驗(yàn)室利用流式細(xì)胞術(shù)和自動(dòng)生化檢測儀，檢測和計(jì)算它們的數(shù)量、比例和濃度，通過分析得到的數(shù)據(jù)，可以推測出機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫狀態(tài)的變化。

患者感染肺炎支原體和人HCMV后，臨床癥狀主要有咳嗽、發(fā)熱、頭痛、咽喉痛等，感染5～10 d后癥狀逐漸消失，因此選擇病程為<7 d的呼吸科肺炎患者作為早期肺炎的研究對象。共收集研究對象160例，其中診斷為重癥肺炎7例，由于例數(shù)較少，且各指標(biāo)水平與非重癥病例相比沒有觀察到明顯差異，所以未進(jìn)行單獨(dú)分組比較研究。本文中關(guān)于HCMV肺炎的研究結(jié)果與同類研究結(jié)果相近[15-18]，而關(guān)于肺炎支原體肺炎的結(jié)果與同類文章的結(jié)果略有出入[19-22]。由于本研究選擇的都為感染早期病例，患者機(jī)體處于免疫系統(tǒng)系統(tǒng)激發(fā)早期，因此感染中后期的淋巴細(xì)胞亞群水平和免疫球蛋白水平變化沒有涉及，可以推測的是：在肺炎支原體感染的中后期或臨床治療的介入后，患者各項(xiàng)指標(biāo)可能發(fā)生了不同趨勢的改變，導(dǎo)致了數(shù)據(jù)分析結(jié)果的不確定，具體結(jié)論有待于在將來的進(jìn)一步研究中探討。

在肺炎支原體肺炎的早期，機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫發(fā)生明顯活化，CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例明顯增加，CD3+CD4+/ CD3+CD8+比值升高，表明在感染的早期即快速激活了免疫系統(tǒng)應(yīng)答，促進(jìn)和調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的反應(yīng)；CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例增高，表明體液免疫相關(guān)細(xì)胞增多，被激活后可產(chǎn)出大量免疫球蛋白；免疫球蛋白中IgM濃度明顯上升，反映了B細(xì)胞在比例升高的基礎(chǔ)上，活化產(chǎn)出大量IgM。在HCMV肺炎的早期，機(jī)體則顯示不同的免疫狀況：CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例改變不明顯，CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例明顯升高，表明病毒感染早期即激活了細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞，啟動(dòng)針對細(xì)胞的殺傷反應(yīng)； CD3-CD19+淋巴細(xì)胞比例增高，表明體液免疫相關(guān)細(xì)胞增多，被激活后可產(chǎn)出大量免疫球蛋白；三種免疫球蛋白IgM、IgA和IgG的濃度明顯下降，反映了在HCMV感染早期，B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白的能力被明顯抑制。對于兩種病原體肺炎的淋巴細(xì)胞亞群分析可以看出：肺炎支原體感染早期表現(xiàn)為CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例升高的比較明顯，而HCMV則表現(xiàn)為CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例更加明顯，雖然比較二者CD3+CD4+/ CD3+CD8+比值沒有明顯差異(P=0.05)，但已呈現(xiàn)出一高一低的變化趨勢。比較兩者免疫球蛋白濃度變化，可以發(fā)現(xiàn)肺炎支原體肺炎病人的總體免疫球蛋白濃度要略高于HCMV感染的病人，主要體現(xiàn)在IgM和IgA的濃度明顯較高。以上說明了無論是肺炎支原體肺炎還是HCMV肺炎早期，機(jī)體的的細(xì)胞免疫和體液免疫都是明顯活化的，但前者表現(xiàn)更為明顯。以上的結(jié)果與另一種呼吸道常見病原體肺炎鏈球菌相比，對人體免疫指標(biāo)的影響有著不同的特點(diǎn)[23-24]。在不同病原體拷貝數(shù)的患者免疫指標(biāo)的比較中，肺炎支原體高拷貝組患者的免疫球蛋白IgA和IgM的濃度高于低拷貝組患者，說明了兩種免疫球蛋白濃度變化對于病原體濃度改變更加敏感；而HCMV高拷貝組患者CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例明顯高于低拷貝組患者，CD3+CD4+/ CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比值也相應(yīng)的較低，說明了CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例和CD3+CD4+/ CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比值的對病原體濃度高低變化更敏感。不同病原體的感染對患者免疫系統(tǒng)平衡狀態(tài)的改變各不相同，對于肺炎支原體肺炎患者，可以監(jiān)測血液中的免疫球蛋白IgA和IgM的濃度的變化，對于HCMV肺炎患者，則可以選擇監(jiān)測CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比例和CD3+CD4+/ CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比值兩項(xiàng)指標(biāo)。

綜上所述，利用流式細(xì)胞技術(shù)和自動(dòng)生化指標(biāo)檢測系統(tǒng)，檢測兩種肺炎患者血中淋巴細(xì)胞亞群和血清免疫球蛋白濃度并且進(jìn)行的分析，明確病原體引起患者免疫系統(tǒng)失衡狀態(tài)的程度，對輔助病原體感染后臨床評估以及制定相應(yīng)個(gè)體化免疫治療方案具有重要參考價(jià)值。