多黏菌素B對(duì)大鼠全腦缺血再灌注時(shí)脂多糖所致?lián)p傷的保護(hù)作用及機(jī)制*

鄭思敏， 李思遠(yuǎn)， 牛曉麗， 楊毅猛， 薛榮亮

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 麻醉科， 陜西 西安 710041)

研究表明，腦缺血再灌注損傷的機(jī)制由多因素共同參與并相互作用。低血壓、休克、心臟驟?？芍氯矶嗥鞴偃毖渲心c道是敏感器官。腸道缺血引起腸黏膜屏障受損，大量釋放細(xì)菌內(nèi)毒素入血，啟動(dòng)多損傷環(huán)節(jié)，對(duì)腸外器官造成損傷[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)存在于革蘭陰性菌的細(xì)胞膜上，是一種內(nèi)毒素，在對(duì)動(dòng)物發(fā)病機(jī)理的研究中，LPS作為主要的炎癥因子，可引起機(jī)體發(fā)熱、血壓下降、激活炎癥反應(yīng)等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，LPS多聚體與宿主的LPS結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)結(jié)合后，激活外周血單核細(xì)胞表面的LPS受體，即白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)，通過(guò)LPS/ Toll樣受體4 (toll like receptor 4,TLR4)信號(hào)通路激活相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等早期促炎因子的生成，如血小板激活因子、白三烯等促炎因子，進(jìn)而加重各器官的損傷[3]。多黏菌素是從多黏桿菌中分離的一類抗生素，用于臨床的有多黏菌素B(polymycin B，PMB)和多黏菌素E(polymycin E，PME)，PMB通過(guò)其具有疏水性的陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)與類脂A特異性結(jié)合，抑制LPS的生物活性[4]。關(guān)于PMB在腦缺血再灌注損傷的中的作用機(jī)制目前尚未完全清楚，因此，本研究通過(guò)建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，并尾靜脈注射用PMB及LPS，分析大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、海馬組織的細(xì)胞凋亡率、LPS含量及TLR4表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康清潔的成年雄性SD大鼠144只，體質(zhì)量200～250 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中實(shí)驗(yàn)心提供，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(SH組)、模型組(IR組)、脂多糖組(LPS組)和多黏菌素B組(PMB+LPS組)，每組36只。后3組大鼠采用經(jīng)典四血管法建立大鼠全腦缺血再灌注模型[5]，LPS組再灌注后即刻尾靜脈注射LPS(500 μg/kg)[6]，PMB+LPS組再灌注后即刻尾靜脈注射LPS、注射完畢后立即更換注射器尾靜脈注射PMB(0.5 mg/kg)[7]，SH組及IR組再灌注后即刻注射等量生理鹽水。每組根據(jù)再灌注時(shí)間的不同再分為2、6、12、24、48及72 h 六個(gè)亞組，每亞組6只。各組大鼠按要求在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)麻醉后處死。

1.1.2試劑和儀器 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，LPS購(gòu)自美國(guó)sigma公司PMB購(gòu)自美國(guó)INALCO公司，Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；液氮罐由中國(guó)成都生產(chǎn)，超凈工作臺(tái)購(gòu)自美國(guó)Airtech公司，低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，包埋機(jī)購(gòu)自德國(guó)leica公司，烤片機(jī)購(gòu)自德國(guó)leica公司，石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)leica公司，倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)leica公司，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備 采用四血管法建立大鼠全腦缺血再灌注模型[5]。10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，大鼠翻正反射及痛覺(jué)消失視為麻醉滿意；麻醉滿意后采用俯臥位固定四肢，頭前傾約30°，同時(shí)用橡皮筋栓住大鼠尾巴以輕微力量牽拉，使頸椎伸直，此時(shí)翼小孔呈水平位便于觀察；取枕骨下第一頸椎水平做正中切口，逐層分離肌肉，仔細(xì)分離雙側(cè)第一頸椎橫突，暴露翼小孔，雙側(cè)翼小孔下各有椎動(dòng)脈通過(guò)，用燒紅的探針刺入翼小孔燒灼椎動(dòng)脈，使之永久閉塞，避免損傷脊髓及枕后三角區(qū)神經(jīng)，逐層縫合皮下及皮膚。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，保持室溫20～25 ℃，并用60 W白熾燈持續(xù)照射24 h，防止體溫下降；同時(shí)保持大鼠呼吸道通暢，密切觀察其復(fù)蘇過(guò)程。術(shù)后第2天，同法麻醉后仰臥位固定，取頸正中切口，仔細(xì)分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(注意勿傷及與之伴行的迷走神經(jīng))、分別微動(dòng)脈夾夾閉6 min、松開(kāi)微動(dòng)脈夾恢復(fù)腦血流、逐層嚴(yán)密縫合。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，條件如前。SH組僅進(jìn)行組織解剖及縫合，不給予凝斷椎動(dòng)脈及夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈處理。

1.2.2神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[9]大鼠處死前30 min由一名不清楚實(shí)驗(yàn)分組的研究人員對(duì)所有大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，分為步態(tài)協(xié)調(diào)、平衡木實(shí)驗(yàn)及斜扳試驗(yàn)。(1)步態(tài)協(xié)調(diào)：缺失(表現(xiàn)為靜止或原地轉(zhuǎn)圈)記1分，不正常(表現(xiàn)為步態(tài)搖晃且速度減慢)記2分，正常記3分。(2)平衡木實(shí)驗(yàn)：大鼠放置于長(zhǎng)1 m、寬2 cm、離地面0.5 m的圓形平衡木上，記錄大鼠的表現(xiàn)；立即脫落記1分，試圖停留記2分，可正常停留記3分。(3)斜扳試驗(yàn)：將大鼠頭向下倒置在45°斜面上，觀察大鼠是否能轉(zhuǎn)為頭向上>135°及爬行情況，迅速轉(zhuǎn)為頭向上>135°、且可順利向上爬記1分，抓握斜面>5 s后轉(zhuǎn)為頭向上>135°、爬行困難記2分，順斜面下滑記3分。

1.2.3LPS含量 各組大鼠按要求在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)麻醉后處死、斷頭，撬開(kāi)顱骨，完整取出大腦組織置于盛有4 ℃ PBS溶液的培養(yǎng)皿中，剝離腦膜和腦皮質(zhì)分離出雙側(cè)海馬組織，立即置入液氮罐凍存，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行ELISA檢測(cè)LPS含量。

1.2.4細(xì)胞凋亡率檢測(cè)[8]按照1.2.3的方法分離出大鼠雙側(cè)海馬組織，再用PBS溶液洗去海馬組織上殘留血液后放入裝有4 ℃ PBS溶液的離心管中，置入冰盒保存，在30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5海馬CA1區(qū)TLR4陽(yáng)性表達(dá) 將不同時(shí)間點(diǎn)處死的各組大鼠沿枕骨撬開(kāi)顱骨，仔細(xì)剝離蛛網(wǎng)膜及軟膜，取出完整大腦，在視交叉后1 mm及視交叉后4 mm處各切一刀(即海馬頭端)取冠狀面組織塊；于4%多聚甲醛液中浸泡，4 ℃保存3 d，常規(guī)石蠟包埋，并采用切片機(jī)連續(xù)腦冠狀面切片制備蠟塊。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察各組大鼠各時(shí)點(diǎn)缺血再灌注的右側(cè)海馬組織病理學(xué)變化，胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色即表示陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選擇海馬CA1區(qū)5個(gè)視野(× 400)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，與LPS組相比，IR組和LPS+PMB組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分增加(P<0.05)，但上述3組各時(shí)點(diǎn)評(píng)分均低于SH組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 再灌注后不同時(shí)點(diǎn)4組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

2.2 海馬組織LPS含量

結(jié)果顯示，4組大鼠各時(shí)點(diǎn)LPS含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中SH組各時(shí)點(diǎn)海馬區(qū)LPS含量最低，LPS組最高(P<0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，IR組和LPS組大鼠海馬組織LPS含量均于再灌注2 h時(shí)開(kāi)始增多，24 h達(dá)高峰，隨后緩慢下降，且各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于SH組(P<0.01)；LPS+PMB組大鼠海馬組織各時(shí)間點(diǎn)LPS含量較LPS組均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 再灌注后不同時(shí)點(diǎn)4組大鼠海馬組織LPS含量

2.3 海馬細(xì)胞凋亡率

結(jié)果顯示，SH組海馬細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率變化不明顯(P>0.05)，其他3組于再灌注后2 h海馬細(xì)胞的凋亡率開(kāi)始升高、24 h達(dá)峰值、72 h開(kāi)始下降；各時(shí)點(diǎn)海馬細(xì)胞凋亡率比較LPS組>IR組>LPS+PMB組>SH組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 再灌注后不同時(shí)點(diǎn)4組大鼠海馬細(xì)胞凋亡率

2.4 海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞損傷

HE染色結(jié)果顯示，與SH組比較，IR組各亞組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞受損嚴(yán)重；LPS組2 h亞組大鼠海馬可見(jiàn)少量異常椎體細(xì)胞，胞漿強(qiáng)嗜酸性變、核固縮、無(wú)核仁消失，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，椎體細(xì)胞排列紊亂、異常細(xì)胞數(shù)目增多、體積縮小，胞漿、胞核固縮明顯，可見(jiàn)核仁消失，核碎裂，溶解；以24 h亞組受損最為嚴(yán)重。LPS+PMB組大鼠海馬組織學(xué)改變介于LPS組與IR組之間。再灌注24 h各組海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。

注：箭頭所指為陽(yáng)性細(xì)胞。

2.5 海馬CA1區(qū)TLR4陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)

結(jié)果顯示，SH組及IR組大鼠海馬CA1區(qū)各時(shí)點(diǎn)TLR4表達(dá)較少，LPS組大鼠海馬CA1區(qū)大鼠海馬CA1區(qū)TLR4的表達(dá)于再灌注2 h時(shí)即出現(xiàn)升高、24 h達(dá)高峰、72 h表達(dá)下降(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+PMB組及IR組大鼠海馬CA1區(qū)各時(shí)點(diǎn)的TLR4表達(dá)均下降(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖2。

注：箭頭所指為陽(yáng)性細(xì)胞。

表4 再灌注后不同時(shí)點(diǎn)4組大鼠海馬CA1區(qū)TLR4陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)

3 討論

當(dāng)機(jī)體處于低血壓、休克、心臟驟停及腦卒中等狀態(tài)中時(shí)可出現(xiàn)腦缺血再灌注[10]，因?yàn)槟X組織的能量幾乎完全依靠葡萄糖的有氧氧化提供，其能量?jī)?chǔ)備十分有限，故對(duì)缺氧耐受性極差[11]。因此，缺血再灌注會(huì)引起一系列的病理生理改變，使大腦出現(xiàn)嚴(yán)重的機(jī)能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，常溫狀態(tài)下，完全缺血10 s，腦組織儲(chǔ)備氧即可耗盡，葡萄糖有氧代謝終止，2～4 min腦組織儲(chǔ)存的葡萄糖及糖原耗竭，完全缺血4 min后，腦組織內(nèi)能量幾乎為零，最終導(dǎo)致大腦功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變[12]。因此，對(duì)于腦缺血再灌注的病理生理及保護(hù)機(jī)制的研究至關(guān)重要。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的程序化死亡過(guò)程，具有主動(dòng)性、選擇性、可逆性的特點(diǎn)。它的發(fā)生受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控。凋亡并不完全等同于程序性的細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)，凋亡是腦缺血再灌注損傷的主要病理生理機(jī)制之一[13]。腸道是失血性休克缺血再灌注損傷受累最早的器官之一，是應(yīng)激反應(yīng)的中心，且腸道對(duì)休克的反應(yīng)最敏感。在休克有效循環(huán)血量減少時(shí)，機(jī)體為維持心、腦等重要臟器的血液供應(yīng)，全身血液重新分配，胃腸道血流明顯減少。低血容量尚未產(chǎn)生全身癥狀或生命體征變化時(shí)小腸和結(jié)腸的血流已減少50%，故腸道缺血發(fā)生在早期[14-16]。即使經(jīng)過(guò)復(fù)蘇，在血流動(dòng)力學(xué)恢復(fù)正常后，腸道血流量仍低于正常水平。腸內(nèi)細(xì)菌經(jīng)腸黏膜至局部淋巴結(jié)或血液的這一現(xiàn)象稱為細(xì)菌移位，細(xì)菌移位可引發(fā)菌血癥或膿毒血癥，感染組織器官。腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素吸收入血，作用于靶器官，釋放大量炎性介質(zhì)、氧自由基，前列腺素及多種細(xì)胞因子，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)和全身代謝紊亂，最終導(dǎo)致遠(yuǎn)端器官的損害[17-19]。已經(jīng)有研究報(bào)道LPS對(duì)肺臟、肝臟、腎臟等組織缺血再灌注時(shí)的損傷作用[20]，但對(duì)腦組織的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，除對(duì)照組外，其他各組再灌注后2 h海馬神經(jīng)元開(kāi)始發(fā)生凋亡，且凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高，于24 h達(dá)峰值，72 h開(kāi)始下降。且LPS組各時(shí)點(diǎn)的凋亡率均高于其他3組，提示LPS可增加全腦缺血再灌注導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元凋亡。但對(duì)LPS組小鼠尾靜脈注射PMB后，各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)LPS含量均較LPS組減少，神經(jīng)元凋亡率下降，提示PMB可能對(duì)損傷起到一定的抑制作用[21-22]。

進(jìn)一步對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，結(jié)果提示PMB+LPS組的評(píng)分高于LPS組，再次提示在大鼠全腦缺血再灌注時(shí)，PMB對(duì)內(nèi)毒素所致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。SH組各時(shí)點(diǎn)血清TLR4表達(dá)很少，而其他3組于再灌注2 h即出現(xiàn)升高，24 h達(dá)高峰，之后開(kāi)始減少，但仍處于較高水平，且均高于SH組。研究還發(fā)現(xiàn)LPS組各時(shí)點(diǎn)均較IR組表達(dá)增加，而LPS+PMB組各時(shí)點(diǎn)均較IR組表達(dá)減少，提示PMB對(duì)大鼠全腦缺血再灌注時(shí)造成的損傷可以起到一定的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制了TLR4的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[23-25]。

綜上所述，全腦缺血再灌注時(shí)腦組織內(nèi)LPS含量隨時(shí)間不斷變化并造成大腦損傷，PMB對(duì)該種損傷有保護(hù)作用，可能是通過(guò)抑制TLR4的表達(dá)進(jìn)而阻止損傷。