移植卒中患者腸道菌群后大鼠血清同型半胱氨酸變化對抑郁障礙的影響及機制*

妙煒， 段昌嶸， 謝雨萌， 鄭蕾*

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 精神科， 貴州 貴陽 550004)

腦卒中是全球第二大死亡原因，也是單病種致殘率最高的疾病[1]。卒中后抑郁(post-stroke-depression，PSD)是腦卒中后常見的一種并發(fā)癥,不僅降低了腦卒中患者的生活質量、進一步增加了腦卒中患者的死亡率[2-3]。卒中后抑郁的機制復雜，包括社會心理因素和生物學因素兩個方面[4]；近期研究發(fā)現(xiàn)卒中所導致的腸道菌群紊亂與抑郁密切相關[5]，調節(jié)腸道菌群紊亂可以在一定程度上改善患者的抑郁狀態(tài)[6-7]。值得注意的是，卒中后抑郁患者同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)會異常增高，這可能影響單胺類神經遞質的合成，導致抑郁癥狀的出現(xiàn)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂將導致葉酸(folic acid，F(xiàn)A)、維生素B12(vitamin B12，VB12)降低，F(xiàn)A和VB12是Hcy代謝的重要原料，缺乏FA和VB12可導致Hcy無法被蛋氨酸合成酶和亞甲基四氫葉酸還原酶再甲基化為蛋氨酸和四氫葉酸，可能最終導致了Hcy水平增高[10]?；谏鲜鲅芯?，本研究通過向大鼠體內移植卒中患者紊亂的腸道菌群，采用16S測序技術測定大鼠糞便中所含細菌的優(yōu)勢菌群變化情況，同時檢測大鼠體內Hcy、FA和VB12水平，以驗證卒中后腸道菌群紊亂對大鼠抑郁癥狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物與分組 選取SPF級健康雄性(Sprague Dawley)SD大鼠40只，體質量250～300 g，購買于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心[合格證號SYXK(黔)2018-0001]，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心1周適應環(huán)境，正常晝夜節(jié)律，自由攝食飲水，室溫(21±2)℃。本實驗操作流程經學校倫理委員會審批通過(編號1901085)。SD大鼠40只，隨機均分為實驗組(移植卒中患者腸道菌群+慢性應激刺激)、益生菌保護組(移植卒中患者腸道菌群+慢性應激刺激+口服益生菌)、對照組(移植正常人腸道菌群+慢性應激刺激)及空白組(僅移植正常人腸道菌群)；空白組每籠飼養(yǎng)10只，其他組采用分養(yǎng)法，每籠1只(孤養(yǎng))。

1.1.2藥物和試劑 鹽酸環(huán)丙沙星(哈藥三精，批號1812003)，青霉素V鉀片(重慶科瑞，批號429001)，法羅培南鈉膠囊(上海衡山，批號180901)，甲硝唑片(山東魯西，批號20180802)，雙歧桿菌四聯(lián)活菌片(杭州遠大，批號S20060010)，大鼠葉酸(FA)酶聯(lián)免疫分析(上海廣銳，貨號ER511)，維生素B12(VB12)酶聯(lián)免疫分析(上海廣銳，貨號ER2017)，同型半胱氨酸(Hcy)酶聯(lián)免疫分析(上海廣銳，貨號ER2285)，糞便DNA提取試劑盒(QIAamp)。

1.2 實驗方法

1.2.1卒中患者和正常健康人腸道菌群灌注液制備 所選3例腦卒中患者符合第四屆全國腦血管病學術會議修訂的缺血性卒中診斷標準[11]，發(fā)病至少1周以上，年齡40～65歲，既往無精神疾病及其他慢性疾病史，無長期藥物使用史，近6周內無腸道疾病及使用抗生素藥物史；使用無菌盒采集患者清晨中段糞便約20 g，迅速送至實驗室加無菌注射用水20 mL混勻，雙層紗布過濾，靜置，將過濾后的樣本以6 000 r/min(離心半徑為13.5 cm)離心15 min，將沉淀物再次懸浮于50 mL等滲鹽水中，得到無色無味的糞菌液置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。另選3名健康個體年齡、性別等與卒中患者相匹配，排除既往及近期無卒中病史、胃腸疾病病史、精神心理病史、成癮性藥物或其他非成癮性藥物依賴史，近6周內無使用抗生素藥物史，糞便取材。

1.2.2動物造模 分別將鹽酸環(huán)丙沙星、法羅培南膠囊、甲硝唑片及青霉素V鉀片研磨，根據(jù)體質量計算大鼠4種抗生素用量后混勻，對4組大鼠進行抗生素灌胃處理[12]，連續(xù)灌胃10 d，破壞大鼠原有腸道菌群，提升腸道菌群移植成功率。抗生素灌胃結束后，各組按計劃移植腸道菌群。實驗組每日灌腸500 μL、連續(xù)3 d，同時給予大鼠糞菌液500 μL灌胃、每3 d重復操作1次，直至第4周慢性應激造模結束時，以維持腸道菌群的穩(wěn)定；且每天給予1種慢性應激刺激。在4周內相繼給予大鼠孤養(yǎng)并中度不可預測應激處理：動物予以夾尾2 min、禁水禁食24 h、45 ℃環(huán)境5 min、晝夜顛倒24 h、傾斜鼠籠24 h、4 ℃冰水游泳5 min、潮濕墊料24 h共7種方法刺激，這7種刺激每天隨機采取1種，共安排4周。對益生菌保護組在移植卒中患者腸道菌群及慢性應激刺激的同時予益生菌口服，對照組移植正常人腸道菌群及予慢性應激刺激，空白組僅移植正常人腸道菌群。

1.2.3取材 造模第4周末，從大鼠肛門處收集新鮮糞便約1 g，每次收集的糞便均置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫缓髮⒋笫舐樽頂囝^后取血，于4 ℃冰箱保存過夜，第2天以6 000 r/min離心 15 min，檢測血清中Hcy，VB12及FA水平(按試劑盒說明書)。糞便標本解凍以后，按照糞便基因組DNA快速提取試劑盒的操作手冊，提取細菌DNA。

1.2.4檢測指標 在實驗前1 d、第2周及第4周稱取大鼠體質量后進行糖水偏好實驗及曠場實驗。第4周末時評價實驗造模情況同時檢測Hcy、VB12、FA水平及大鼠腸道細菌群落(雙歧桿菌屬、普雷沃菌屬、大腸桿菌屬、顫螺菌屬、擬桿菌屬、梭狀桿菌屬、羅斯式菌屬、別樣桿菌屬)構成情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 體質量

實驗前各組大鼠體質量測量結果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。第2周末及第4周末時，各組大鼠體質量增長值均低于空白組(P<0.05)；第4周末時實驗組和益生菌保護組體質量增長值低于對照組(P<0.05)。見表1、圖1。

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與對照組比較，P<0.05。

表1 各組大鼠體質量變化情況

2.2 行為學觀察

糖水偏好試驗，第2周末及第4周末時，與空白組比較，實驗組和益生菌保護組大鼠的消耗量降低(P<0.05)；第2周末時，實驗組糖水消耗量低于對照組，快感缺失更明顯(P<0.05)。在曠場試驗中，第2周末時，實驗組的總路程短于對照組、活動減少程度更明顯(P<0.05)；與空白組比較，實驗組、益生菌保護組及對照組大鼠的總路程明顯縮短(P<0.05)；實驗組和益生菌保護組大鼠的平均速度慢于空白組(P<0.05)；第4周末時，實驗組及益生菌保護組大鼠的總路程均短于空白組(P<0.05)；實驗組大鼠的總路程短于對照組(P<0.05)。見圖2、圖3、圖4。

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與對照組比較，P<0.05。

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與對照組比較，P<0.05。

注：(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與對照組比較，P<0.05。

2.3 大鼠腸道菌群構成

大鼠糞便檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組、對照組雙歧桿菌屬含量低于益生菌保護組(P<0.05)；實驗組雙歧桿菌屬、普雷沃菌屬、大腸桿菌屬、顫螺菌屬含量低于對照組，益生菌保護組顫螺菌屬含量低于對照組(P<0.05)；實驗組雙歧桿菌屬、普雷沃菌屬、大腸桿菌屬、顫螺菌屬含量低于空白組，益生菌保護組普雷沃菌屬、大腸桿菌屬、顫螺菌屬含量低于空白組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腸道菌群構成

2.4 血清VB12、FA、Hcy含量

第4周末，實驗組大鼠血清VB12和FA含量低于對照組、Hcy含量高于對照組(P<0.05)，益生菌保護組大鼠血清VB12含量低于對照組、Hcy含量高于對照組(P<0.05)，空白組大鼠血清VB12及FA含量高于對照組(P<0.05)；實驗組及益生菌保護組大鼠血清VB12及FA含量低于空白組、Hcy含量高于空白組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清VB12、FA、Hcy含量比較

3 討論

腸道菌群移植技術是研究腸道菌群對疾病發(fā)生、發(fā)展影響的常用技術[13]。本研究采用和人腸道菌群類似的SPF級SD大鼠作為研究對象[14]，采取了移植卒中后患者腸道菌群至大鼠體內，模擬卒中后腸道菌群紊亂模型，以此為基礎觀察卒中后腸道菌群的改變是否會導致抑郁的發(fā)生、加重，并檢測在移植后大鼠血清VB12、FA、Hcy水平，以了解血清VB12、FA、Hcy變化及抑郁程度之間的關系。結果顯示，與對照組比較，實驗組大鼠體質量下降、快感缺失、活動減少等抑郁癥狀更明顯，證明了移植卒中后患者腸道菌群的大鼠抑郁易感性較移植健康人群腸道菌群的大鼠有所增加，與文獻報道[15]一致。

本研究中，與移植健康人群腸道菌群的對照組相比，移植卒中患者腸道菌群的VB12、FA水平更低，Hcy水平更高，這種變化可能與腸道菌群結構改變相關，實驗組大鼠雙歧桿菌屬、普雷沃氏菌屬、大腸桿菌屬、顫螺菌屬豐度較對照組明顯降低，雙歧桿菌屬、大腸桿菌屬已被證實在體內可以合成大量VB12[16-17]，且雙歧桿菌屬也可合成FA[18]。缺乏FA及VB12將導致高同型半胱氨酸血癥的發(fā)生(hyperhomocys- teinemia，HHcy)。Hcy的代謝通過蛋氨酸循環(huán)實現(xiàn)，該過程需要有FA與VB12的參與[19]，F(xiàn)A既是一種水溶性B族維生素，也是人類體內重要的微量元素[20]。若蛋氨酸循環(huán)途徑發(fā)生障礙，則腦內神經中樞的甲基供體SAM生成則減少，使得單胺類神經遞質如多巴胺(dopamine，DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去甲腎上腺素(norepi-nephrine，NE)等的生成和代謝發(fā)生紊亂，而上述這些神經遞質在PSD的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[21]。Hcy是目前導致神經精神系統(tǒng)疾病發(fā)生的一項重要因素[22]。Almeida等[23]發(fā)現(xiàn)當血漿Hcy濃度降低0.19 mg/L時，抑郁癥的發(fā)生率將降低20%。國內研究者王海鵬等[24]發(fā)現(xiàn)，102例PSD患者中有68例伴有Hcy，占總病例數(shù)的2/3，PSD患者的抑郁程度與血漿Hcy濃度呈正相關。在本實驗中，從行為學實驗及體質量變化上來看，在第2周時實驗組與益生菌保護組糖水偏好程度及活動量的減少都明顯比對照組及空白組更嚴重，體質量的下降也更加明顯，但到第4周時，4組大鼠曠場實驗中平均速度無明顯差異，這可能與除腸道菌群紊亂之外的導致行為學變化的其他因素開始作用有關。理論上，益生菌特別是雙歧桿菌，被認為具有調節(jié)腸道功能、改善神經系統(tǒng)功能從而減輕焦慮、抑郁癥狀的作用[25]。而本研究中，益生菌保護組在體質量變化、曠場實驗、糖水實驗表現(xiàn)較實驗組無明顯改善，可能因為本研究中選用的雙歧桿菌四聯(lián)活菌片主要為改善腹瀉及腹部不適，益生菌保護組結構改善不明顯，與Hcy密切相關的細菌結構變化不大，并且實驗對象不同，可能削弱了雙歧桿菌的定植效果。且較高劑量的雙歧桿菌屬的攝入是否能影響葉酸的合成，也需進一步驗證。腸道菌群中的普雷沃菌屬及顫螺菌屬也與動物行為學變化成正相關，但尚未有研究顯示它們與VB12及FA的產生有關聯(lián)，它們與Hcy之間的關系還需進一步探索。

綜上所述，卒中后患者腸道菌群的紊亂會導致抑郁障礙的加重，這種現(xiàn)象可能與腸道菌群紊亂導致VB12及FA的合成下降，從而導致HHcy有關，為今后治療和預防PSD提供了新的臨床思路。