黃連素聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌PANC-1細胞增殖及凋亡的影響*

宋春灼， 李想， 李俊俊， 劉猛， 付立躍， 朱海濤*

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院, 貴州 貴陽 550004)

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，患者的5年生存率低于5%[1-2]。胰腺癌患者的預后差的原因部分歸因于局部腫瘤侵襲和遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤的極端耐藥等[3]。吉西他濱(gemcitabine，GEM)是目前胰腺癌化療“金標準”中的首選藥物之一[4]， 但晚期胰腺癌患者在治療過程中極易對GEM產(chǎn)生耐藥，單用GEM在臨床治療中的效果并不理想，患者的中位生存期僅約4～6個月[5-6]。因此，尋找新的藥物聯(lián)合GEM應(yīng)用在胰腺癌的臨床治療中非常重要。近年來，隨著對中藥研究的不斷加深，已發(fā)現(xiàn)大黃素、苦參堿等對胰腺癌具有抗腫瘤作用[7-8]。黃連素(berberine，BBR)又名小柴堿，是從黃連、黃柏等植物中提取的一種藥用價值很高的化合物，具有抗炎、降脂、降糖以及抗氧化等多種藥理作用[9-12]；有報道黃連素被用于肺癌、胃癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中，且具有抗腫瘤作用[13-15]，張勁等[16]研究表明黃連素通過增加Caspase-3表達促進胰腺癌細胞的凋亡。因此，本研究將BBR以及BBR聯(lián)合GEM作用于胰腺癌PANC-1細胞，觀察兩種用藥方式在體外對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1購自中國科學院干細胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器 GEM(美國Selleck Chemicals公司)、BBR(美國Sigma公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶溶液(美國Gibco公司)、胎牛血清(以色列Biological Industries公司)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO，美國Hycione公司)、CCK-8細胞毒性試劑盒(上海Dojido)、細胞裂解液、4%多聚甲醛、0.01%結(jié)晶紫(廣州Affinity)；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、兔抗人B細胞白血病/淋巴瘤2凋亡調(diào)節(jié)因子(Bcl-2)單克隆抗體、兔抗人B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白X(BAX)單克隆抗體(武漢Proteintech Group)、山羊抗兔二抗(武漢Boster)，371型恒溫細胞培養(yǎng)箱、多功能酶標儀(美國Thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物配置 人胰腺癌PANC-1細胞在含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，細胞融合度達90% 時進行傳代處理，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。BBR和GEM均用 DMSO 配制成 10 mol/L的母液放置于-20 ℃冰箱中儲存，用時以DMEN高糖培養(yǎng)基稀釋成各個濃度的工作液使用。

1.2.2篩選最佳藥物濃度 取對數(shù)生長期的PANC-1細胞，用胰酶消化制備細胞懸液并計數(shù)；于96孔板中每孔種植 5×103個細胞，每組5個復孔，另設(shè)一組只加DMEM高糖培養(yǎng)基作為調(diào)零組。待細胞貼壁后，將細胞分為對照1組(未處理)、12.5 μmol/L BBR組、25.0 μmol/L BBR組以及50.0 μmol/L BBR組，48 h后吸去培養(yǎng)基，向每孔中加入配置好的含CCK-8的溶液110 μL(DMEM培養(yǎng)基 ∶CCK-8溶液=100 ∶10),在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，于酶標儀450 nm波長下讀取各孔吸光度值(optical density,OD值)，并計算各組細胞的抑制率及藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。細胞抑制率(%)=[(對照組OD值-實驗組OD值) / (對照組OD值-調(diào)零組OD值) ]×100%，藥物對PANC-1細胞的IC50是在GraphPad 8.3軟件中通過藥物各濃度對細胞的抑制率構(gòu)建非線性回歸函數(shù)公式得出。在研究GEM單藥作用時，細胞貼壁后，以0.0、0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L的GEM處理細胞48 h，后續(xù)操作同黃連素單藥應(yīng)用。在研究BBR聯(lián)合GEM作用時，根據(jù)BBR藥物對PANC-1細胞的IC50，選取25.0 μmol/L BBR進行聯(lián)合用藥實驗；細胞貼壁后，以0.0、0.1、1.0、10.0和100.0 μmol/L GEM聯(lián)合25.0 μmol/L BBR處理細胞48 h，后續(xù)操作同上。應(yīng)用金氏計算公式計算藥物協(xié)同指數(shù)(q值)，q=EA+B/[EA+(1-EA)×EB]，其中EA、EB分別表示A藥物和B藥物單獨使用時對細胞的抑制率，EA+B表示A藥物和B藥物聯(lián)合使用時對細胞的抑制率。q>1.15時表示藥物存在協(xié)同效應(yīng)。根據(jù)計算的q值選擇協(xié)同抑制效果最佳的藥物濃度組合進行后續(xù)實驗。

1.2.3分組 根據(jù)GEM和BBR對PANC-1細胞的IC50值以及各藥物濃度組合的q值，將細胞分為對照2組(未處理)、GEM組(1.0 μmol/L GEM)、BBR組(25.0 μmol/L BBR)以及聯(lián)合組(25.0 μmol/L BBR聯(lián)合1.0 μmol/L GEM)。

1.3 觀察指標

1.3.1細胞克隆形成數(shù) 取對數(shù)生長期的 PANC-1 細胞，胰酶消化制備細胞懸液并計數(shù)，在 6孔板中每孔種值1×103個細胞；細胞貼壁之后，按上述分組處理PANC-1細胞，待 12 d后吸去皿里的培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，烘干，拍照并計算各組細胞的克隆數(shù)。

1.3.2Bcl-2和BAX蛋白表達 收集各組細胞，用含苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)蛋白酶抑制劑的細胞蛋白裂解液裂解30 min，超聲破碎10 s，以12 000 r/min在4 ℃下離心10 min，收集上清蛋白液；在蛋白液中加適量 5×loading buff在100 ℃下變性10 min；取50 μg 蛋白上樣，用10%的丙烯酰胺凝膠經(jīng)100 V恒定電壓電泳2 h、250 mA 恒定電流轉(zhuǎn)膜90 min至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用含5%的脫脂奶粉在常溫下封閉 2 h；分別加入稀釋度為 1 ∶1 000 的Bcl-2、BAX和GAPDH一抗，4 ℃過夜后，洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌 3 次，加入稀釋度為1 ∶5 000 二抗室溫孵育 2 h，滴加高敏曝光液在 Bio-rad成像系統(tǒng)中曝光。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 最佳藥物濃度

CCK-8結(jié)果顯示，BBR在PANC-1細胞中的IC50為39.92 μmol/L(圖1A)，GEM對PANC-1細胞IC50為29.07 μmol/L；25.0 μmol/L BBR聯(lián)合不同濃度GEM作用時，其對PANC-1細胞IC50為1.604 μmol/L。通過金氏公式計算得出，25.0 μmol/L BBR聯(lián)合GEM(0.1、1、10、100 μmol/L)共同作用時，q值分別為1.08、1.42、1.26、1.18，見圖1B。其中，25.0 μmol/L BBR聯(lián)合1.0 μmol/L GEM作用時協(xié)同抑制效果最佳，此聯(lián)合濃度用于后續(xù)研究。

注：A為BBR單藥對細胞的抑制率，B為GEM單藥或聯(lián)合BBR對細胞的抑制率。

2.2 克隆形成數(shù)

克隆形成數(shù)研究結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著BBR濃度增加，細胞克隆數(shù)形成逐漸減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2A、圖2B。與對照組相比，GEM組、BBR組和聯(lián)合組的PANC-1細胞克隆形成數(shù)均減少，且聯(lián)合組細胞克隆形成減少較GEM組和BBR組更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2C、圖2D。

2.3 PANC-1細胞中Bcl-2和BAX蛋白表達

與對照組相比，隨著BBR濃度的增加，Bcl-2表達逐漸降低， BAX表達逐漸增加(P<0.05)，見圖3A～圖3C。與對照組相比，GEM組、BBR組和聯(lián)合組細胞中Bcl-2表達降低，BAX表達增加，且聯(lián)合組細胞中Bcl-2蛋白表達降低及BAX蛋白表達增加較GEM組和BBR組均更明顯(P<0.05)，見圖3D～圖3F。

注：A為不同濃度BBR處理的細胞蛋白結(jié)果，B為Bcl-2相對表達量，C為BAX相對表達量，D為BBR、GEM及聯(lián)合用藥處理的細胞蛋白結(jié)果，E為Bcl-2相對表達量，F(xiàn)為BAX相對表達量；(1)與對照1組或2組比較，P<0.05；(2)與聯(lián)合組比較，P<0.05。

3 討論

對于不能進行手術(shù)切除治療的晚期胰腺癌患者，化療發(fā)揮了極其重要的作用。GEM作為目前晚期胰腺癌治療的一線化療藥物，主要作用于細胞分裂的G1/S期，通過抑制DNA合成、修復及誘導細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤的作用[17-19]。然而，胰腺癌的發(fā)展是一個建立在遺傳和表觀改變基礎(chǔ)上的多步驟過程，隨著疾病不斷發(fā)展，晚期胰腺癌患者即使采用全身性支持治療，效果仍不理想，且患者在治療后期可能會出現(xiàn)對GEM耐藥的情況[20]。因此，目前臨床治療晚期胰腺癌患者的主要策略是將GEM與其他細胞毒性藥物或靶向藥物聯(lián)用，以降低患者對GEM耐藥的發(fā)生[21-23]。這意味著尋找一種或多種新的藥物聯(lián)合GEM應(yīng)用尤為重要。

BBR在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用，其抗腫瘤機制包括調(diào)節(jié)細胞自噬、調(diào)控細胞周期、抑制細胞增殖及增強藥物敏感性等[24]。在本實驗中，重點研究應(yīng)用BBR單藥以及聯(lián)合GEM應(yīng)用對胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響，用不同濃度BBR(12.5、25.0、50.0 μmol/L)在體外作用于人胰腺癌PANC-1細胞，CCK-8、克隆形成等實驗結(jié)果表明BBR能抑制胰腺癌細胞增殖，且抑制細胞增殖的能力與劑量呈依賴關(guān)系；接下來，本實驗還探究了在胰腺癌中BBR與GEM聯(lián)用的可能性，通過計算BBR單藥應(yīng)用在PANC-1細胞中的IC50值，選取25.0 μmol/L BBR與不同濃度GEM聯(lián)合應(yīng)用，并通過金氏公式計算得出，25.0 μmol/L BBR聯(lián)合GEM(1.0、10.0、100.0 μmol/L)時均發(fā)揮協(xié)同作用抑制胰腺癌細胞增殖，且在25.0 μmol/L BBR聯(lián)合1.0 μmol/L GEM時協(xié)同作用最佳。

細胞凋亡是細胞的程序性死亡過程，主要受以Bcl-2家族和caspase3家族為主的多基因調(diào)控[25-26]。Bcl-2 和BAX是Bcl-2家族的成員，主要通過改變線粒體膜上電位，釋放下游相關(guān)促凋亡因子，促發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導細胞凋亡[27-28]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GEM能通過上調(diào)BAX蛋白表達促進胰腺癌細胞凋亡[29]。李舒等[30]研究表明，BBR能通過下調(diào)Bcl-2及上調(diào)BAX蛋白表達促進人胃癌細胞SGC7901的凋亡。因此，本研究檢測不同處理組PANC-1細胞中Bcl-2及BAX蛋白表達情況，結(jié)果表明，BBR聯(lián)合GEM能顯著下調(diào)細胞中Bcl-2蛋白表達及上調(diào)BAX蛋白表達，提示BBR聯(lián)合GEM作用可以通過調(diào)節(jié)細胞中Bcl-2及BAX蛋白表達，從而誘導胰腺癌細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，BBR能抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖并促進凋亡，且與GEM聯(lián)用能發(fā)揮協(xié)同作用，能增強GEM單藥應(yīng)用的敏感性，使抑制細胞增殖和誘發(fā)細胞凋亡的能力增強。BBR有望成為GEM治療胰腺癌的有效聯(lián)合藥物之一。