甲基蓮心堿對(duì)人下咽癌FADU細(xì)胞增殖和凋亡的影響

陳霞 謝紅衛(wèi) 王永鵬 張曉萍 梁卉

【摘要】 目的：探討甲基蓮心堿對(duì)人下咽癌FADU細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制。方法：分別用不同濃度0μmol/L（CN組）、1μmol/L（LN組）、3μmol/L（MN組）和6μmol/L（HN組）的甲基蓮心堿體外干預(yù)FADU細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變、采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖的影響，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)FADU細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：CCK-8法結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，甲基蓮心堿用藥組可明顯抑制人下咽癌FADU細(xì)胞增殖，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）;并可誘導(dǎo)FADU細(xì)胞凋亡，隨藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡愈明顯。結(jié)論：甲基蓮心堿可體外抑制人下咽癌FADU細(xì)胞的增殖、并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】甲基蓮心堿;人下咽癌FADU細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

【中圖分類號(hào)】R730.4 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? 【文章編號(hào)】2026-5328（2021）09--02

甲基蓮心堿（Neferine，Nef）是從蓮心中提取出來(lái)的一種雙芐基異喹啉類生物堿，研究表明它具有抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗纖維化、抗血小板聚集等作用。近年來(lái)研究亦發(fā)現(xiàn)，甲基蓮心堿在肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要的抗腫瘤作用。雖然目前甲基蓮心堿的抗腫瘤作用研究甚多，但應(yīng)用于頭頸部惡性腫瘤的報(bào)道十分少見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的甲基蓮心堿體外干預(yù)FADU細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖和凋亡等生物學(xué)行為影響，為進(jìn)一步研究人下咽癌細(xì)胞機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.材料

人下咽癌FADU細(xì)胞購(gòu)自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;甲基蓮心堿購(gòu)自上海源葉生物公司;胎牛血清購(gòu)自上海四季青公司;DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone;細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8）購(gòu)上海碧云天生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Annexin V法）購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司。

2.方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)：FADU細(xì)胞用10%胎牛血清和1x105U/L青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行觀察及下一步研究。

2.2形態(tài)學(xué)觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期FADU細(xì)胞胰酶消化傳代后，分成四組，計(jì)數(shù)以2x105個(gè)/mL的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度0μmol/L（CN組）、1μmol/L（LN組）、3μmol/L（MN組）和6μmol/L（HN組）的甲基蓮心堿液進(jìn)行干預(yù)共同培養(yǎng)，24小時(shí)后，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖/毒性影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞胰酶消化后，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)至2×104/mL，每孔100μL接種到96孔板中，預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（37℃，5%CO2），待細(xì)胞貼壁后加入10μL四種不同濃度0μmol/L（CN組）、1μmol/L（LN組）、3μmol/L（MN組）和6μmol/L（HN組）的甲基蓮心堿溶液進(jìn)行干預(yù)，分別進(jìn)行0h，24h，48h，72h的分段培養(yǎng)，并在對(duì)應(yīng)時(shí)間段加入10μL CCK-8反應(yīng)液（不生成氣泡），孵育1-2h，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定吸光度（OD）并記錄數(shù)值，按公式計(jì)算各組增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-用藥組OD/對(duì)照組OD）×100%。

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)FADU細(xì)胞凋亡的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期FADU細(xì)胞胰酶消化后，密度調(diào)至2×105/mL，接種到6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，加入現(xiàn)配的0μmol/L（CN組）、1μmol/L（LN組）、3μmol/L（MN組）和6μmol/L（HN組）甲基蓮心堿液干預(yù)，48小時(shí)后，PBS液洗滌細(xì)胞2次，加入5μl V-FITC與5μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)10分鐘，分別加入400μL 1× Binding Buffer，混勻后置于冰上，1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并記錄。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS20.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1甲基蓮心堿干預(yù)FADU細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)觀察：與CN組比較，用藥組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)皺縮或變形，細(xì)胞核皺縮較為明顯，細(xì)胞膜內(nèi)陷，并出現(xiàn)觸角樣改變，隨著藥物劑量濃度加大，細(xì)胞皺縮愈明顯。

3.2CCK-8法檢測(cè)甲基蓮心堿對(duì)FADU細(xì)胞的增殖影響：結(jié)果顯示，與CN組比較用藥組細(xì)胞增殖明顯受抑制，抑制率差異明顯（P<0.05）;不同濃度給藥組（LN組、MN組和HN組）組間相互比較，細(xì)胞增殖抑制率差異也十分顯著（P<0.05），且抑制程度呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性（見(jiàn)表1）。

4.討論

人下咽癌（hypopharyngeal carcinoma）屬頭頸部的惡性腫瘤，占頭頸部惡性腫瘤發(fā)病率的5-10%[1]，95%以上是鱗狀細(xì)胞癌，75%以上的患者在醫(yī)院診斷為下咽癌時(shí)均已處于中晚期，大都發(fā)生了局部浸潤(rùn)及淋巴結(jié)等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此下咽癌的預(yù)后極差[2]。手術(shù)+術(shù)后放化療是目前臨床治療下咽癌的最佳方法，但手術(shù)切除病灶作為目前下咽癌的首選治療方案[3]，術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，五年生存率僅不到35%[4]。術(shù)后綜合放射治療和化學(xué)治療的方案，可提高生存率，但下咽癌細(xì)胞的易侵襲性、易轉(zhuǎn)移性嚴(yán)重影響了下咽癌的治愈率，使其術(shù)后復(fù)發(fā)率及死亡率高居不下。目前下咽癌主要使用順鉑等鉑類抗癌藥物[5]進(jìn)行術(shù)后的化學(xué)治療，此抗腫瘤藥物毒副作用較大，且費(fèi)用昂貴，因此尋找一種更加有效、安全且經(jīng)濟(jì)的方法對(duì)于下咽癌患者具有十分重要的臨床價(jià)值和意義。

甲基蓮心堿是一種從植物蓮中提取出來(lái)的天然藥物，研究表明，Nef具有抗炎、抗氧化等作用，另有研究表明甲基蓮心堿可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期和影響腫瘤細(xì)胞自噬而發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)可提高化療的敏感性、降低腫瘤治療毒性等重要作用。如Nef可通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），谷胱甘肽（GSH）等誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[6，7];可通過(guò)調(diào)節(jié)cyclinD等阻滯骨肉瘤細(xì)胞周期進(jìn)程[8]。甲基蓮心堿可調(diào)節(jié)P-gP和 MRP逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥性[9];可調(diào)節(jié)MAPK通路等加強(qiáng)阿霉素對(duì)肺癌細(xì)胞治療作用[10];可調(diào)節(jié)粘著蛋白、波形蛋白等增加奧沙利鉑對(duì)肝癌細(xì)胞的敏感性[11];還可調(diào)節(jié)線粒體轉(zhuǎn)位等增強(qiáng)化療藥物對(duì)乳腺癌的治療作用[12]。甲基蓮心堿在增強(qiáng)抗腫瘤作用的同時(shí)，可通過(guò)催化自由基的形成降低阿霉素對(duì)心臟的毒性[13]，可通過(guò)激活MAPK/mTOR信號(hào)通路降低順鉑對(duì)腎臟的毒性[14，15]。本研究結(jié)果表明，甲基蓮心堿用藥組可明顯抑制FADU細(xì)胞增殖，隨著濃度增加，抑制率也增高;而用藥組的細(xì)胞凋亡數(shù)量較對(duì)照組數(shù)量高，濃度愈高細(xì)胞凋亡愈明顯。

總之，甲基蓮心堿可抑制人下咽癌FADU細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，但具體是通過(guò)什么信號(hào)途徑或方式使細(xì)胞凋亡，仍需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?Takes R， Strojan P，Silver C，et al. Current trends in initial management of hypopharyngea cancer： the declining use of open surgery[J]. Head and Neck. 2012，34：270-281.

[2] Joo Y H，Cho K J，Lee Y S， et al. Prognostic impact of perineural invasion in hypopharyngeal squamous cell carcinoma[J]. Acta Otolaryngol， 2016，136：1069-1073.

[3] 劉良發(fā)，董研博.下咽癌的外科治療進(jìn)展[J].中國(guó)耳鼻咽喉顱底外科雜志，2017，23（3）：189-195.

[4] 張宗敏，唐平章，徐震綱等.下咽癌不同治療方案的臨床分析[J]，中華腫瘤雜志，2005，27（1）：48-51.

[5] 路鐵，李振東，李樹(shù)春等，321例下咽癌患者臨床特征及兩種治療方式療效分析[J]，臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2019，33（3）：275-279.

[6]Poornima P，Quency R，Padama V.Neferine induces reactive oxygen species mediated intrinsic pathway of apoptosis in HepG2 cells[J].Food Chem，2013，136（2）：659-667.

[7] 周雅君，時(shí)菁，田耕等，甲基蓮心堿體外抑制人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2016，32（11）：1539-1542.

[8]Yoon J，Kim H，Yadunandam A， et al. Neferine isolate from Nelumbo nucifera enhances anti-cancer activities in Hep3B cells：molecular meechanisms of cell cycle arrest， ER stress induced apoptosis and anti-angiogenic response[J]. Phytomedicine，2013，209（11）：1013-1022.

[9]甲基蓮心堿對(duì)長(zhǎng)春新堿抑制人胃癌細(xì)胞增殖作用的影響[J]，臨床腫瘤學(xué)雜志，2008，5（13）：427-431.

[10]甲基蓮心堿增強(qiáng)順氯氨鉑對(duì)Lewis肺癌的化療作用[J]，腫瘤學(xué)雜志，2004，10（1）：17-19.

[11]甲基蓮心堿體外抑制人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)制研究[J]，中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2016，32（11）：1539-1542.

[12]甲基蓮心堿逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2/thermotolerance細(xì)胞對(duì)阿霉素耐受性的作用[J]，癌癥，2007，26（4）：357-360.

[13]張永飛，崔久嵬。化療藥物所致心臟毒性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)腫瘤臨床，2018，45（24）：1243-1247.

[14]楊慧海，王露露，范超等，中藥有效成分減輕順鉑腎毒性研究進(jìn)展[J]。上海中醫(yī)藥雜志，2017，51（5）：98-101.

[15]Li H，Tang Y，Wen l，et al. Neferine reduces cisplaytin-induced nephrotoxicity by enhancing antophagy via the MAPK/Mtor signaling pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，484（3）：694-701.

作者簡(jiǎn)介：陳霞，1980.10 ，女，漢 ，江西省 萍鄉(xiāng)市，碩士 ，講師 ， 研究方向或從事工作：耳鼻咽喉腫瘤發(fā)病機(jī)制研究