半纖維素降解產(chǎn)物糖醛酸的測定方法研究進(jìn)展

羅 敏 付時(shí)雨

（華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640）

木質(zhì)纖維（Lignocellulose）是地球上豐富可再生的生物質(zhì)資源，被人們用于能源、建材、家具以及化學(xué)品的生產(chǎn)。近年來，隨著綠色經(jīng)濟(jì)的興起，生物質(zhì)基液體原料、生物質(zhì)基可再生材料的研究和利用成為熱門研究課題，被人們所關(guān)注。木質(zhì)纖維資源傳統(tǒng)利用，主要是通過脫除木質(zhì)纖維中的木素，或者木素和半纖維素獲得紙漿或者纖維素產(chǎn)品；大部分脫除的木素和半纖維素被焚燒后為堿回收提供部分熱能，只有少部分的木素和半纖維素用于生產(chǎn)高值化產(chǎn)品[1]。實(shí)際上，生物質(zhì)中的半纖維素脫除或者保留對纖維素的降解與轉(zhuǎn)化，以及纖維素纖維的功能化具有重要影響。眾所周知，半纖維素是由多種糖基構(gòu)成的不均一聚糖，是影響生物質(zhì)組分分離的重要因素。在植物天然結(jié)構(gòu)中，木質(zhì)纖維細(xì)胞壁主要以纖維素為骨架物質(zhì)，半纖維素覆蓋在纖維素微纖絲表面并以氫鍵連接，半纖維素還與木素間以共價(jià)鍵連接，從而形成疏水結(jié)構(gòu)[2]，也就是半纖維素與木素形成的木素-碳水化合物復(fù)合體（LCC）。

當(dāng)植物纖維用于化學(xué)法制漿時(shí)，原料中的木素需要盡可能多地脫去，使纖維易于分散，同時(shí)纖維素降解盡可能少，適當(dāng)保留部分半纖維素[3]。當(dāng)植物纖維用于生物煉制時(shí)，則主要是打開植物纖維致密結(jié)構(gòu)和聚合物的分子鏈，使纖維素、木素和半纖維素得到有效分離，然后纖維素糖化、發(fā)酵成為能源和化學(xué)品。如果要實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)組分高效分離，并有利于纖維素后續(xù)利用，則需要深入研究半纖維素的降解產(chǎn)物，特別是半纖維素的降解模式與規(guī)律。無論是制漿過程，還是生物煉制過程，半纖維素降解和溶出伴隨葡萄糖醛酸的降解和轉(zhuǎn)化。本文將概述半纖維素的降解反應(yīng)，并對糖醛酸和己烯糖醛酸的測定進(jìn)行詳細(xì)介紹。

1 半纖維素堿性降解反應(yīng)

不同植物材種中半纖維素聚糖類型和結(jié)構(gòu)不同，針葉木以聚半乳糖葡萄糖甘露糖為主，而闊葉木以聚-O-乙?；?4-O 甲基葡萄糖醛酸木糖為主[4]。各類半纖維素聚糖在堿性條件下會發(fā)生降解反應(yīng)，可根據(jù)反應(yīng)條件和程度分為堿性水解和剝皮反應(yīng)。在較為劇烈的反應(yīng)條件下與纖維素水解類似，如170℃、10%NaOH 溶液中，半纖維素糖苷鍵水解斷裂形成小分子糖基和糖醛酸基。在較為溫和的反應(yīng)條件下，半纖維素會發(fā)生剝皮反應(yīng)[5]，生成新的短鏈多聚糖，其上含有不均一的還原性末端基（即異變糖酸基），而降解下來的末端基在堿液中進(jìn)一步互變異構(gòu)轉(zhuǎn)變成乳酸等降解產(chǎn)物。

降解產(chǎn)物中含有大量甲酸、乙酸以及20 種以上的羥基羧酸、16 種以上的羥基二元酸和不飽和酸[6]。當(dāng)還原性末端基轉(zhuǎn)變?yōu)槠兲撬峄鶗r(shí)，剝皮反應(yīng)終止，不再進(jìn)行半纖維素的降解。除了化學(xué)降解，半纖維素的溶解也受到傳質(zhì)效應(yīng)的控制，水解產(chǎn)物中的木素降解產(chǎn)物也會阻礙半纖維素的溶解[7]。

在堿性制漿蒸煮中，4-O-甲基葡萄糖醛酸基（meGlcA）易于脫除，因此蒸煮后所得到的半纖維素聚木糖鏈支鏈減少，聚合度降低，容易隨著堿液參數(shù)變化而發(fā)生變化。4-O-甲基葡萄糖醛酸在蒸煮液中受到高溫強(qiáng)堿（OH-）的作用，發(fā)生β-甲醇消除反應(yīng)形成雙鍵，生成4-脫氧-己烯糖醛酸（HexA），反應(yīng)過程如圖1 所示。HexA 在堿性條件下相對穩(wěn)定，可以阻止聚木糖分子鏈發(fā)生剝皮反應(yīng)，但隨著蒸煮時(shí)間增加，HexA 會發(fā)生部分降解，同時(shí)，由于其對酸不穩(wěn)定，易被水解成呋喃衍生物[8]。在后續(xù)紙漿漂白過程中，會與漂白試劑發(fā)生反應(yīng)，從而增加漂白試劑的消耗。在制漿中，蒸煮方法和堿液濃度會影響紙漿中最后殘留的HexA 含量[9]。由于針葉木中所含聚4-O-甲基葡萄糖醛酸木糖較少，其產(chǎn)生的HexA 也相應(yīng)較少。每10 μmol/g 的HexA 對卡伯值的貢獻(xiàn)為0.84～0.86，在硫酸鹽法蒸煮中，針葉木的HexA 含量約為20～30 μmol/g，闊葉木則為50～60 μmol/g[10]。

圖1 堿性蒸煮下HexA的形成[10]Fig.1 Formation of HexA after alkaline cooking[10]

2 降解產(chǎn)物的測定方法

在生物煉制過程中，要提高生物質(zhì)組分的分離效率，需要測定其在分離過程中的降解產(chǎn)物含量和分布，以實(shí)現(xiàn)纖維素能源轉(zhuǎn)化或者材料制備。如前所述，半纖維素在制漿蒸煮中有很大程度的殘留，保留的半纖維素含有糖基、糖醛酸、HexA 等成分。研究人員為了測定這些成分做了許多重要的研究，其中甲基葡萄糖醛酸的降解轉(zhuǎn)化和HexA 的產(chǎn)生備受關(guān)注，其定量測定十分重要，下面將重點(diǎn)介紹其測定方法。

2.1 糖醛酸類物質(zhì)的測定

2.1.1光譜法

糖類物質(zhì)一般不具備紫外吸收或熒光基團(tuán)，較為常用的方法是將其衍生化后使用比色法測定。此方法測定的優(yōu)點(diǎn)是快速顯色、方便快捷、對儀器設(shè)備要求較低，適宜于大批量樣品分析，但存在衍生化后產(chǎn)物不穩(wěn)定，測量結(jié)果誤差較大，并且容易受中性雜質(zhì)干擾等缺點(diǎn)。

糖醛酸（葡萄糖醛酸）與濃硫酸在沸水浴條件下能夠發(fā)生水解反應(yīng)，生成呋喃化合物5-甲酰基-2-呋喃甲酸（5FF）[11]，水解產(chǎn)物再與顯色試劑反應(yīng)能夠生成具有顯色基團(tuán)的化合物，根據(jù)顯色基團(tuán)的吸光度能夠測定出糖醛酸的含量。但是，樣品中存在的己糖和戊糖也會酸水解為5-羥甲基-2-呋喃甲酸、2-呋喃甲酸醛等產(chǎn)物，對糖醛酸測定造成干擾。常用的顯色試劑有咔唑、間羥基聯(lián)苯、3,5-二甲基苯酚等，根據(jù)不同的顯色反應(yīng)發(fā)展了其相應(yīng)的測定方法[12]。

咔唑-硫酸法通過咔唑與葡萄糖醛酸水解產(chǎn)物生成紫紅色化合物，其吸光度與葡萄糖醛酸濃度成正比，測定波長范圍在523～530 nm。Gregory[13]發(fā)現(xiàn)在濃硫酸中加入硼酸鹽能夠改變中間體的形成，增強(qiáng)葡萄糖和葡萄糖醛酸酮的羥甲基和羧甲基反應(yīng)，進(jìn)而加快顯色時(shí)間，增加顏色的穩(wěn)定性。李敏等人[14]采用改良咔唑-硫酸法測定糖醛酸的含量，在酸水解后采用冰水浴迅速冷卻的方法，延長了顯色體系的穩(wěn)定時(shí)間，有利于樣品的測定。需要注意的是，中性糖在加熱酸水解的過程中會發(fā)生褐變，對顯色反應(yīng)造成較大干擾，特別是二次加熱，需要對測定結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)。

間羥基聯(lián)苯法是通過葡萄糖醛酸與硫酸-硼砂溶液反應(yīng)，水解產(chǎn)物與間羥基聯(lián)苯（MHDP）絡(luò)合顯色，生成粉紅色化合物，并利用比色法測定糖醛酸的含量。相較于咔唑-硫酸法，間羥基聯(lián)苯法可以在初次加熱水解糖醛酸后與MHDP在環(huán)境溫度下反應(yīng)，避免了二次加熱，減少了中性糖的干擾。Filisetti等人[15]為解決加入MHDP 前第一次加熱過程中發(fā)生的褐變，在反應(yīng)混合物中加入少量氨基磺酸鹽以消除褐變，而不會影響MHDP對糖醛酸的靈敏檢測，特別是當(dāng)糖醛酸含量比中性糖少得多時(shí)。Albert 等人[11]研究了不同反應(yīng)時(shí)間下MHDP/5FF 發(fā)色基團(tuán)在520 nm 處的吸光度隨糖醛酸含量的變化，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)結(jié)果穩(wěn)定性差，需要在測定時(shí)建立新的方法以提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。林妲等人[16]探究了最佳反應(yīng)條件，有效測定了堿分級分離提取所得半纖維素中葡萄糖醛酸的含量，并能夠保證顯色反應(yīng)完成后2 h內(nèi)吸光度變化不大。

2.1.2色譜法

木質(zhì)纖維水解液中產(chǎn)物的色譜測定方法主要有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法（IC）等。GC 主要通過將產(chǎn)物衍生化后轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的物質(zhì)進(jìn)行測定，衍生化過程往往較為復(fù)雜、重現(xiàn)性差，常用的衍生化方法有硅烷化、乙酰化等；HPLC 是采用聚葡萄糖凝膠色譜柱分離后測定成分含量，常與柱前/柱后衍生化反應(yīng)與紫外或熒光檢測相結(jié)合，如還原胺化；IC 是利用待測組分電荷數(shù)差異在洗脫液中解離成陰離子后實(shí)現(xiàn)交換分離，操作簡單方便，且無需衍生化就可以進(jìn)行檢測分析，檢測靈敏、準(zhǔn)確度高、外在干擾小，且重現(xiàn)性好，但對儀器要求較高[12]。

常用的多糖產(chǎn)物測定方法是利用硫酸解聚處理，但α-(1→2)-糖醛酸和木糖殘基之間的連接鍵較為穩(wěn)定而不易斷裂，此外酸水解也會引起糖醛酸的脫羧反應(yīng)。相比之下，酸性甲醇醇解法可以主要解聚非纖維素多糖鏈，從而更好地?cái)嗔烟侨┧徇B接鍵，無需預(yù)先脫木素處理[17]。Chong 等人[18]利用酸性甲醇醇解法和氣相色譜法研究了樺木中4-O-甲基葡萄糖醛酸的含量，用鹽酸/甲醇溶液將糖醛酸樣品處理后，進(jìn)一步三甲基硅烷化（TMSi），利用火焰離子化檢測器（FID）進(jìn)行分析檢測，并使用核磁共振光譜測定的摩爾比作為純化標(biāo)準(zhǔn)品的定量。糖醛酸在酸性甲醇醇解過程中會發(fā)生部分內(nèi)酯化，從而在氣相色譜中產(chǎn)生6 個(gè)糖苷峰，與純化標(biāo)準(zhǔn)樣品的校準(zhǔn)曲線結(jié)合，能夠更好地估計(jì)待測meGlcA的含量。

對于糖醛酸的衍生化反應(yīng)使用最多的是還原胺化，反應(yīng)原理是將糖的醛、酮等還原端羰基與伯氨基化合物反應(yīng)，生成Shiff 堿結(jié)構(gòu)化合物后被NaBH3CN還原為仲胺，利用其紫外吸收或熒光進(jìn)行檢測，常用于柱前衍生化后色譜分離檢測，葡萄糖與對氨基苯甲酸的反應(yīng)過程如圖2所示。

圖2 葡萄糖與對氨基苯甲酸的反應(yīng)示意圖[19]Fig.2 Schematic diagram of the reaction between glucose and p-aminobenzoic acid[19]

郝桂堂等人[19]利用柱前衍生高效液相色譜法，將氨基苯甲酸（p-AMBA）衍生化為反相離子后通過反相色譜柱分離檢測單糖及糖醛酸組成，對分離柱系統(tǒng)、流動相洗脫條件等進(jìn)行分析，探究了適合p-AMBA 糖衍生物分離的色譜梯度洗脫分離程序，并優(yōu)化了反應(yīng)溫度70℃和反應(yīng)時(shí)間40 min等衍生化條件，達(dá)到了較高的分離檢測結(jié)果。Silva等人[20]同樣利用反向高效液相色譜熒光檢測法測定了中性糖和酸性糖含量，并提出衍生物的熒光檢測與流動相的pH 值有很強(qiáng)的相關(guān)性，將此法與傳統(tǒng)氣相色譜法-火焰離子化檢測法（GC-FID）對比分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法對中性糖的檢測無顯著差異。

張強(qiáng)等人[21]采用陰離子交換與脈沖安培檢測法（PAD），建立了幾種單糖和糖醛酸的分離和定量分析方法，發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫液濃度為5 mmol/L、淋洗液流速為0.8 mL/min、柱溫為20℃時(shí)，分離度大于1.9，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3，可以在46 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)多種單糖和糖醛酸的完全分離，并且可以根據(jù)糖醛酸的酸度系數(shù)（pKa）值的不同，改變條件使其達(dá)到良好的分離效果。

Lorenzo等人[22]采用高效陰離子交換色譜（HPAEC）與紫外可見光檢測（UV/VIS）結(jié)合的方法，通過2-氨基苯甲酸（2-AA）對糖醛酸進(jìn)行還原胺化，并與常規(guī)的磷酸-HPAEC 法和13C NMR 光譜相比，發(fā)現(xiàn)所檢測到的葡萄糖醛酸濃度有了極大提高，新方法比常規(guī)硼酸-HPAEC 法更靈敏，這表現(xiàn)在相比常規(guī)方法，測定的檢測極限要低很多。

Jacobs 等人[23]利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜（MALDI-MS）的檢測分析方法，研究了4-O-甲基葡萄糖醛酸殘基在木材聚木糖多糖鏈上的分布，并結(jié)合尺寸排阻色譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，針葉木聚木糖的糖醛酸殘基主要規(guī)則地分布在每7 個(gè)或8 個(gè)木糖殘基上，而闊葉木聚木糖中的糖醛酸殘基分布不規(guī)則。各色譜法測定糖醛酸含量的條件對比見表1。

表1 色譜法測定糖醛酸含量的條件對比Table 1 Comparison of conditions for determination of uronic acid content by chromatography

2.2 HexA的測定方法

HexA 是制漿過程中糖醛酸殘基轉(zhuǎn)變而來的降解產(chǎn)物，它能與親電漂白試劑（如Cl2、ClO2、ClO3和過氧酸等）反應(yīng)，從而影響后續(xù)漂白化學(xué)品的消耗，反應(yīng)產(chǎn)物降解后會形成草酸鈣，使得管路和容器結(jié)垢[24]。此外，HexA 含有不飽和化學(xué)鍵，當(dāng)用KMnO4測量紙漿卡伯值時(shí)會對測量結(jié)果產(chǎn)生影響，一些金屬離子容易與HexA 的雙鍵發(fā)生螯合而影響紙漿過氧化物的漂白性能[25]，其分子中的共軛雙鍵是一些發(fā)色基團(tuán)的主要來源，會導(dǎo)致紙漿返黃。因此，對HexA 進(jìn)行定量檢測和含量控制對制漿漂白工藝和提高紙張性能有重要意義[26]。

傳統(tǒng)的HexA 測量方法有聚木糖酶解核磁檢測法、酸化后紫外檢測法、乙酸汞水解液相色譜分離檢測法等，但實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣且不易控制反應(yīng)條件[25]。本文將重點(diǎn)介紹近年來測定HexA 的改進(jìn)方法，具有實(shí)驗(yàn)方法簡便快捷、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。

2.2.1水解法

汞鹽可以水解釋放2-乙酰氨基-2-脫氧-3-O-(β-D-蘇式-4-吡喃葡萄糖醛酸)-D-葡萄糖，此水解產(chǎn)物能夠吸收紫外光從而通過光譜法測定含量。Gellerstedt 等人[27]采用乙酸汞溶液選擇性水解HexA 和聚木糖鏈間的糖苷鍵，再用高碘酸鹽氧化形成3-甲酰丙酮酸后與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅色化合物，但實(shí)驗(yàn)測定中水解緩沖液的紫外吸收較高，產(chǎn)生誤差較大；相比之下，氯化汞的紫外吸收較低，不易對HexA 的含量產(chǎn)生干擾。

Chai 等人[28]在前人的基礎(chǔ)上，提出了一種簡單快速測定HexA 的方法，利用氯化汞-乙酸鈉溶液高度選擇性水解HexA，在適宜的水解條件和溫度下能夠在30 min 內(nèi)完全水解HexA，然后通過紫外分光光度法在260、290 nm 處測定其含量。該研究還表明，紙漿漂白前后此法所得產(chǎn)物的光譜特征相同，表明木素等化合物對測定結(jié)果的影響較小，可通過雙波長分光光度法校正后得到準(zhǔn)確測量數(shù)值，校正如式（1）所示。此法由于簡便迅速、樣品用量少，在2007 年被列入美國制漿造紙學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[25]。

式中，CHexA為HexA 的含量，μmol/g；A260、A290分別為260、290 nm 處的吸光度；V為水解液的體積，mL；w為紙漿樣品的絕干質(zhì)量，g；常數(shù)0.235為使用標(biāo)準(zhǔn)紙漿樣品獲得的校準(zhǔn)系數(shù)[28]。

也有學(xué)者提出以氧化鎘溶液為水解液的UV 測定法[29]，測定波長為231、280 nm，并且可由含有HexA的聚木糖模型物的紫外吸收強(qiáng)度，計(jì)算得到氧化鎘溶液中HexA 的濃度，見式（2）。該方法是基于紙漿樣品在鎘試劑中的溶解，可以同時(shí)測定HexA 和殘余木素，其中木素的吸收必須從總吸收值中減去[30]。

式中，CHexA為HexA 的含量，g/L；A231、A280分別為231、280 nm 處的吸 光度；ε231、ε280分 別為231、280 nm下的吸收系數(shù)。

2.2.2酸解法

HexA 在與酸發(fā)生水解反應(yīng)時(shí)，能夠形成呋喃-2-糠酸和5-羧基-2-糠醛，其產(chǎn)物含量分別是90%和10%，其反應(yīng)過程見圖3。兩種產(chǎn)物分別在245、290 nm 處有紫外吸收。Jiang 等人[31]用陰離子交換色譜法分離呋喃酸產(chǎn)物后用抑制電導(dǎo)法定量，該方法耗時(shí)不超過4 h，重復(fù)性好，可用于各類化學(xué)漿中HexA的測定。Jiang等人[32]用同樣的檢測方法研究了傳統(tǒng)硫酸鹽漿和3種改性硫酸鹽漿（蒽醌漿、聚硫漿、聚硫蒽醌漿）中HexA 的酸水解動力學(xué)，結(jié)果表明，改性硫酸鹽漿中HexA 的酸水解具有非均相性，反應(yīng)可分為兩個(gè)準(zhǔn)一級動力學(xué)相，每個(gè)動力學(xué)相的速率常數(shù)不同。

圖3 HexA基團(tuán)酸降解產(chǎn)物[33]Fig.3 Acid degradation products of HexA groups[33]

為了避免使用危險(xiǎn)化學(xué)品，Zhang 等人[33]在N2條件下，用pH 值3.5 的甲酸/甲酸鈉緩存溶液在110℃下水解紙漿樣品1 h，通過紫外可見光譜法分析所得水解呋喃衍生物的吸光度，能夠確定HexA 的含量。此法溫和而環(huán)保，但未考慮木素等干擾物的影響，適用于漂白后紙漿中HexA 含量測定。詹懷宇等人[34]利用此法測定對比了不同木材原料的未漂常規(guī)硫酸鹽漿（CK）和改良硫酸鹽漿（EK）酸水解前后HexA 的含量，結(jié)果表明，針葉木（濕地松和加勒比松）漿HexA 含量一般為10～30 mmol/kg，闊葉木（尾葉桉、雷林桉）漿的一般為40～70 mmol/kg，約為針葉木漿的2～3倍，

Anna-Stiina 等人[35]提出了通過紫外共振拉曼光譜（UVRR）結(jié)合偏最小二乘法校正同時(shí)測定紙漿中木素和HexA含量的新方法，這是根據(jù)不飽和結(jié)構(gòu)C=O和C=C 的UVRR 條帶高度確定的，其他不飽和結(jié)構(gòu)含量在紙漿中是恒定的，因此該條帶高度與HexA 含量具有線性關(guān)系，與其他方法相比，此法較為快速，且樣品用量少，預(yù)處理過程簡單，操作簡便，不需要化學(xué)處理，但儀器成本高，適用于木素含量小于3%的半漂漿和全漂白紙漿。

不同材種原料用不同方法所測定的HexA 含量見表2。

表2 不同材種原料用不同方法所測定的HexA含量Table 2 HexA content of different materials determined by different methods

3 結(jié)語

長久以來，造紙行業(yè)的學(xué)者對制漿過程中的組分分離進(jìn)行了大量研究，致力于清潔高效地制備紙漿，提升紙張質(zhì)量，并且探究木質(zhì)纖維的高值化利用，開發(fā)生物質(zhì)精煉新模式。半纖維素在制漿和生物煉制中起重要作用，這與半纖維素的溶出或降解對紙漿纖維的性能產(chǎn)生影響有關(guān)。對半纖維素的研究，需要探究其在植物纖維中的降解程度和降解機(jī)理，并分析其結(jié)構(gòu)、測定其含量。纖維原料，特別是闊葉木纖維，在高溫堿性蒸煮過程中，由于發(fā)生剝皮反應(yīng)、氧化反應(yīng)、水解反應(yīng)，部分會降解成為低聚糖或單糖，這些糖類進(jìn)一步降解得到的4-O-甲基葡萄糖醛酸及其堿性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物己烯糖醛酸，這是影響制漿工藝化學(xué)品消耗、制約下游纖維素加工利用的關(guān)鍵因素，對二者的結(jié)構(gòu)和含量變化進(jìn)行分析測定，將對木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)性能和降解機(jī)理的探討提供指導(dǎo)，為改性生物質(zhì)基材料的研究提供新方法和新思路。