伊伐布雷定對心肌肥厚大鼠超極化激活環(huán)核苷酸門控非選擇性陽離子通道和交感神經(jīng)的影響*

周 瑞，黃 河，劉應(yīng)才

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川瀘州 646000)

超極化激活環(huán)核苷酸門控非選擇性陽離子通道(hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated channel,HCN)是編碼起搏電流的通道基因，其中包括HCN1～4共4種亞型。目前哺乳動物心臟上4種亞型均有被檢測到，其分布具有物種依賴的區(qū)域特異性，在正常大鼠心室肌中少量表達(dá)HCN2、HCN4[1-2]。一些基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，HCN表達(dá)的變化與心臟疾病的發(fā)生有關(guān)，例如HCN2-Tg小鼠的HCN2心臟過表達(dá)加重了低鉀血癥的促心律失常事件[3]，HCN4變異與房顫有關(guān)[4]，HCN的變異還可導(dǎo)致心肌疾病的發(fā)生等[5-6]。心肌肥厚是各種心血管疾病的代償結(jié)果，常常發(fā)生室性心律失常，增加心源性猝死風(fēng)險(xiǎn)，從病理角度上，心室肥厚、心肌纖維化與心律失常發(fā)生有關(guān)[7]。在分子生物學(xué)上，相關(guān)研究顯示，心肌肥厚時(shí)心室肌HCN2、HCN4的表達(dá)上調(diào)，因此，本課題組猜測HCN表達(dá)上調(diào)延遲了心室動作電位的復(fù)極時(shí)間，即QT間期延長導(dǎo)致心室肌興奮性增強(qiáng)，從而產(chǎn)生心律失常[8-9]。伊伐布雷定是心臟竇房結(jié)起搏電流通道的高度選擇性和特異性抑制劑，與β受體阻滯劑比較，伊伐布雷定的耐受性更好，不會影響心臟的傳導(dǎo)、收縮和復(fù)極作用，所以也不會對血壓造成明顯影響,另外，伊伐布雷定在降低心率的同時(shí)并不影響交感神經(jīng)對心率的控制[10-11]。目前，對心肌肥厚時(shí)心肌細(xì)胞HCN的變化及伊伐布雷定對交感神經(jīng)的影響的數(shù)據(jù)尚不足，故本研究通過構(gòu)建大鼠心肌肥厚模型，旨在探討伊伐布雷定對心肌肥厚大鼠HCN及交感神經(jīng)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)動物：雄性SD大鼠18只，無特殊病原體(SPF)級，體重250～300 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。(2)試劑：鹽酸伊伐布雷定(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，戊巴比妥鈉(德國Sigma公司)，注射用青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)，ELISA試劑盒(上海僑杜生物有限公司)，熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司)。(3)儀器：病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(印度Diatek公司)，熒光定量PCR儀(美國Life technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1動物模型建立

將18只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組和伊伐布雷定組(IVA組)，每組各6只。模型組和IVA組術(shù)前常規(guī)禁食、禁飲12 h。將3%戊巴比妥鈉在大鼠下腹部行腹腔注射(0.15 mL/100 g)，固定頭部和四肢。在劍突下1～2 cm處大小2 cm×3 cm～2 cm×4 cm的區(qū)域進(jìn)行剃毛、聚維酮碘消毒。沿腹白線剪開腹部，暴露腹腔，將小腸輕柔移到腹腔右側(cè)，充分暴露出左腎靜脈和下腔靜脈，沿左腎靜脈和下腔靜脈交叉點(diǎn)上方分離腹主動脈。結(jié)扎位置選在雙腎動脈分叉處以上約0.5 cm處，在此位置平行放置鈍化的8號針頭，兩者用4號手術(shù)線扎緊，緩慢退出針頭，剪去線頭，關(guān)閉腹腔，最后再次消毒皮膚。將青霉素用生理鹽水配好后，按照劑量為5×104U/只向大鼠腹腔注射，療程3 d以避免感染。同時(shí)提高環(huán)境溫度，術(shù)后24 h只飲水，第2天開始正常飲食。Sham組只掛線標(biāo)記不結(jié)扎，其余操作同另外兩組。

1.2.2藥物干預(yù)

術(shù)后12周，IVA組予以鹽酸伊伐布雷定(10 mg·kg-1·d-1)灌胃，該劑量參照目前相關(guān)研究[12]，其余兩組予以等體積生理鹽水灌胃，共5周。

1.2.3心肌質(zhì)量指數(shù)

實(shí)驗(yàn)第17周末，所有大鼠處死前稱量體重(body weight，BW)，麻醉后迅速打開胸腔，抽取左心室血液約3 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，將血清標(biāo)本移入1.5 mL EP管中，放入—80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將心臟分離后立即置入冰磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，輕輕擠壓排出室腔內(nèi)殘留血液，然后將非心肌組織剪除，用濾紙吸干后稱重即得全心質(zhì)量(heart weight，HW)。剪取室間隔和左心室游離壁，用濾紙吸干后，稱重即得左心室質(zhì)量(left ventricular weight，LVW)。最后計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)=HW/BW，左心室質(zhì)量指數(shù)=LVW/BW。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色

3組大鼠心肌質(zhì)量指數(shù)測定完畢后，剪取心尖部向上約0.5 cm處左心室心肌組織，固定于4%多聚甲醛，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色后在顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.2.5免疫組織化學(xué)法測HCN2和HCN4分布情況

取大鼠室間隔心肌組織經(jīng)石蠟包埋切片后，用免疫組織化學(xué)染色檢測HCN2和HCN4的表達(dá)分布。

1.2.6Western blot檢測HCN2和HCN4蛋白表達(dá)水平

取大鼠室間隔心肌組織，用預(yù)冷的PBS漂洗2～3次，勻漿，離心后取上清液，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。配制分離膠、濃縮膠，上樣后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜并加入封閉液室溫封閉1 h。除去封閉液，加入稀釋好的一抗4 ℃過夜，回收一抗，用TBST洗3次，每次5 min。加入稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗4次，每次5 min。滴加新鮮配制的電化學(xué)發(fā)光(ECL)混合溶液(A∶B=1∶1)到膜的蛋白面?zhèn)龋凳抑衅毓?。用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度值。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測HCN2和HCN4 mRNA表達(dá)

施工項(xiàng)目往往不能像“公司”機(jī)構(gòu)一樣長期存在，所以大部分制度只是沿用或者干脆空缺，部分材料驗(yàn)收制度不完善。在材料驗(yàn)收過程中，大部分只是按照約定俗成的“規(guī)矩”進(jìn)行驗(yàn)收，這就造成在發(fā)生特殊情況的時(shí)候，沒有制度依據(jù)，缺乏相應(yīng)的應(yīng)急機(jī)制，管理混亂，降低工作效率。

取大鼠左心室室間隔組織約20 mg，用TRIpure提取總RNA。采用EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒合成第一鏈cDNA，反應(yīng)條件37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR儀上完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣品均作3個(gè)復(fù)孔，使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行(ELK Biotechnology,EQ001)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性10 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.8免疫組織化學(xué)法檢測交感神經(jīng)的分布

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)在交感神經(jīng)纖維中呈陽性，故本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)法檢測TH的表達(dá)來分析檢測心室肌中交感神經(jīng)的分布。取大鼠左心室游離壁組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋，切片，脫蠟，用PBS洗3次。切片置于乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液中微波修復(fù)，PBS清洗 3 次，置于3%過氧化氫溶液中，室溫下避光孵育10 min。PBS洗3次，甩干后5% BSA封閉20 min。去除BSA液，每張切片加入約50 μL稀釋的一抗，4 ℃過夜。PBS洗3次，去除PBS，每張切片加50～100 μL相應(yīng)種屬的二抗，37 ℃孵育50 min。PBS洗3次，去除PBS，每張切片加50～100 μL新鮮配制DAB溶液，顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化(約1 s)，自來水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片經(jīng)過由低到高濃度梯度的乙醇，各10 min，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。鏡檢。

1.2.9ELISA檢測心肌組織去甲腎上腺素(noradrenalin，NA)和腎上腺素(epinephrine，EPI)水平

實(shí)驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)標(biāo)本從冰箱取出，室溫溶解；提前30 min從冰箱中取出ELISA試劑盒，平衡至室溫。按照ELISA試劑盒說明書操作步驟分別檢測心肌組織NA和EPI水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌質(zhì)量指數(shù)比較

與Sham組比較，模型組、IVA組全心質(zhì)量指數(shù)、左心室質(zhì)量指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組心肌質(zhì)量指數(shù)比較

2.2 各組心肌HE染色情況

Sham組心肌細(xì)胞規(guī)則緊密；模型組心肌細(xì)胞變長，細(xì)胞核體積增加，排列稀疏、不規(guī)則；IVA組心肌細(xì)胞排列基本整齊，見圖1。

圖1 各組心肌HE染色(×400)

2.3 各組HCN2、HCN4蛋白及mRNA表達(dá)情況

Sham組心肌細(xì)胞少量表達(dá)HCN2、HCN4；與Sham組比較，模型組HCN2和HCN4表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，IVA組HCN2和HCN4表達(dá)減少(P<0.05)，見圖2～4、表2。

表2 各組HCN2、HCN4蛋白和mRNA的相對表達(dá)水平

圖2 HCN2的免疫組織化學(xué)染色(×400)

圖3 HCN4的免疫組織化學(xué)染色(×400)

圖4 Western blot檢測HCN2、HCN4蛋白的表達(dá)情況

2.4 各組TH分布及NA、EPI表達(dá)情況

與Sham組比較，模型組TH分布及NA、EPI表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，IVA組TH分布及NA、EPI表達(dá)減少(P<0.05)，見圖5、表3。

圖5 TH的免疫組織化學(xué)染色(×400)

表3 各組NA和EPI的表達(dá)水平比較

3 討 論

正常情況下，HCN在心臟起搏和傳導(dǎo)系統(tǒng)外表達(dá)很弱，與起搏組織比較，小鼠心室心肌中總HCN轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量要低幾倍，但這種心室低表達(dá)的通道在心臟疾病期間會發(fā)生改變，例如心肌肥厚大鼠心肌細(xì)胞的電流密度和發(fā)生率增加，且這種增加與心肌肥厚的嚴(yán)重程度直接相關(guān)，因此，非起搏組織中“起搏電流”的上調(diào)可能改變心室肌的電穩(wěn)定性，最終可能增加危及生命的心律失常的風(fēng)險(xiǎn)[8]。心肌肥厚是各種心臟疾病的病理改變，早期具有代償意義，后期出現(xiàn)失代償進(jìn)而發(fā)展為心力衰竭，在此過程中常伴有交感神經(jīng)的激活，并進(jìn)一步促進(jìn)心室重構(gòu)及心律失常的發(fā)生。伊伐布雷定是HCN的特異性抑制劑，目前臨床上只將伊伐布雷定用于慢性心力衰竭、冠心病穩(wěn)定型心絞痛和一些快速性心律失常的心率控制中[13-14]，對其除降低心率以外的心臟保護(hù)作用仍在研究中。

本研究通過縮窄大鼠腹主動脈方法成功構(gòu)建心肌肥厚模型，通過Western blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測伊伐布雷定對心肌肥厚大鼠心室肌HCN及交感神經(jīng)的影響，證明了大鼠心肌肥厚時(shí)，心室肌細(xì)胞HCN2和HCN4表達(dá)上調(diào)，TH的分布增加、心肌組織的NA和EPI水平也增加，予以伊伐布雷定干預(yù)后，HCN2和HCN4表達(dá)明顯下調(diào)，TH的分布減少、心肌組織的NA和EPI水平減少，說明伊伐布雷定可以抑制心肌肥厚大鼠心室肌HCN及交感神經(jīng)的表達(dá)。由于伊伐布雷定作用時(shí)間較短，并未改善心肌肥厚，但其減少NA、EPI的表達(dá)可能會抑制交感神經(jīng)對心臟的直接毒性作用。另外，心肌肥厚時(shí)HCN表達(dá)增加，且在交感活動增強(qiáng)時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)心肌細(xì)胞舒張期自動除極，加重引起室性心律失常的發(fā)生，故減少HCN及交感神經(jīng)的表達(dá)，有望降低心律失常發(fā)生率。區(qū)別于β受體阻滯劑對交感神經(jīng)的作用機(jī)制，伊伐布雷定對交感神經(jīng)的影響可能與其多效性有關(guān),相關(guān)研究證明，伊伐布雷定可以減少缺血再灌注損傷時(shí)線粒體活性氧的產(chǎn)生，增加三磷酸腺苷的合成，從而減少心肌梗死面積，與比索洛爾比較更能改善冠狀動脈血流儲備，且還能抑制炎性反應(yīng)，改善ApoE基因敲除小鼠的內(nèi)皮功能，減少心肌纖維化，起到保護(hù)血管、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化作用[15-16]。伊伐布雷定還有積極的正性肌力作用[17],可改善缺血再灌注模型豬的心臟功能[18]。而這與伊伐布雷定降低心率作用無相關(guān)性。

伊伐布雷定可以抑制心肌肥厚大鼠HCN蛋白、mRNA水平和交感神經(jīng)的表達(dá)，這為伊伐布雷定應(yīng)用于臨床心律失常及改善預(yù)后提供了理論依據(jù)，但伊伐布雷定作用于交感神經(jīng)的直接作用仍不清楚，還需進(jìn)一步研究。