食品中水溶性維生素測(cè)定方法的研究現(xiàn)狀

相壇壇，王明月，呂岱竹，郭建峰，梁水連，戎瑜，周佳

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，海南 ?？?571101；2.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西 太原 038507）

維生素是維持人和動(dòng)物身體健康所必需的一種有機(jī)化合物，人體自身不能合成，必須從外界環(huán)境攝取。水溶性維生素作為維生素重要的一部分，對(duì)維持人體的正常生命活動(dòng)極為重要。如維生素C主要參與人體內(nèi)的羥化反應(yīng)及氧化還原反應(yīng)；維生素B1以輔酶的形式參與人體內(nèi)能量與營(yíng)養(yǎng)素的代謝；維生素B2主要參與體內(nèi)能量代謝；維生素B6在人體內(nèi)主要參與氨基酸的合成與分解代謝，催化血紅蛋白合成，促進(jìn)肌肉與肝中的糖原轉(zhuǎn)化等；葉酸對(duì)體內(nèi)紅細(xì)胞的合成有著重要的作用。水溶性維生素主要存在于粗糧、動(dòng)物肝臟、蔬菜等食物中[1]，包括維生素C（VC）、維生素B1（VB1）、維生素B2（VB2）、維生素B3（VB3）、維生素B5（VB5）、維生素B6（VB6）、維生素B7（VB7），維生素B9（VB9）和維生素B12（VB12），當(dāng)人體內(nèi)的水溶性維生素不足或過(guò)量都會(huì)導(dǎo)致許多疾病發(fā)生[2]。

水溶性維生素很不穩(wěn)定，在酸、堿、光、熱等條件下會(huì)發(fā)生降解，因此對(duì)其分析測(cè)定有些困難。傳統(tǒng)的分析方法包括微生物法、分光光度法，隨著現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)的快速發(fā)展，水溶性維生素的檢測(cè)方法也變得更加豐富，超臨界色譜法、高效液相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等多種方法也被應(yīng)用于水溶性維生素的檢測(cè)中，本文就近十年來(lái)現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)在水溶性維生素測(cè)定方法中的應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)單綜述[3-6]。

1 水溶性維生素的檢測(cè)方法

1.1 微生物法

微生物法測(cè)定水溶性維生素含量是一種最常見(jiàn)的水溶性維生素檢測(cè)方法，是利用微生物的特異性，給予一定的營(yíng)養(yǎng)條件或改變微生物的生存環(huán)境，通過(guò)其生長(zhǎng)繁殖和代謝表達(dá)來(lái)完成對(duì)單一維生素成分的測(cè)定。

早在20世紀(jì)五十年代，英國(guó)維生素研究專家就利用微生物對(duì)來(lái)自不同動(dòng)物的奶樣中的維生素B12含量進(jìn)行了測(cè)定。我國(guó)學(xué)者于上世紀(jì)90年代開(kāi)始使用微生物對(duì)食品中的維生素含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)過(guò)近30年不斷的革新發(fā)展，微生物法測(cè)定維生素已非常成熟，在2017年頒布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，利用微生物法分別對(duì)食用農(nóng)產(chǎn)品中的煙酸和煙酰胺、泛酸、吡哆素、生物素及葉酸進(jìn)行了測(cè)定。

利用微生物對(duì)維生素進(jìn)行測(cè)定，微生物本身對(duì)生存環(huán)境極為敏感，且其特異性表達(dá)決定了微生物法檢出限低、靈敏度高、結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也因?yàn)槲⑸镆兹揪?、特異性?qiáng)造成了其具有培養(yǎng)周期長(zhǎng)、重現(xiàn)性差、測(cè)定結(jié)果單一等缺點(diǎn)。劉冬虹等[7]優(yōu)化建立微生物法快速測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中的維生素B12、葉酸、生物素、肌醇4種水溶性維生素的方法。該方法利用甘油保護(hù)菌種，節(jié)省菌種制備時(shí)間，簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，同時(shí)菌種活力更穩(wěn)定，保證了試驗(yàn)的有效性；采用1.2mL PP小管和移液器進(jìn)行操作，減少了大量移液管、玻璃器具的使用，節(jié)省了大量時(shí)間。該方法解決了傳統(tǒng)微生物法試驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜的問(wèn)題。劉志楠等[8]用乳酸桿菌完成了牛奶中泛酸含量的測(cè)定，其在對(duì)泛酸含量測(cè)定時(shí)，應(yīng)用了泛酸試劑盒，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間。各種維生素檢測(cè)試劑盒因其簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)必然將成為檢測(cè)維生素含量的一種不可或缺的工具。

微生物法是檢測(cè)維生素含量最簡(jiǎn)單、最普遍的一種方法，在未來(lái)的發(fā)展中應(yīng)該著力于其較差的重現(xiàn)性及檢測(cè)單一性等方面，從而使該方法更加完善。

1.2 光度法

光度法也是檢測(cè)水溶性維生素的一種常用方法，主要分為分光光度法和熒光光度法。

分光光度法利用水溶性維生素對(duì)紫外光有極強(qiáng)的吸收的特點(diǎn)，測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度。光度法對(duì)水溶性維生素的定性和定量分析，相對(duì)于微生物法，有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)。葉群利等[9]利用分光光度法完成了黃果柑中維生素C的測(cè)定，以抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，結(jié)果準(zhǔn)確、回收率好。但分光光度法在實(shí)際操作中過(guò)程繁瑣，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，且在測(cè)定時(shí)有過(guò)多的干擾項(xiàng)，穩(wěn)定性差。

分子熒光法有靈敏度高，檢出能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，一般用于自身含有熒光基團(tuán)或者衍生后能有熒光特性的物質(zhì)，國(guó)標(biāo)中維生素B1、維生素B2、泛酸、煙酰胺等都采用了熒光光度法。光度法的缺點(diǎn)在于前處理復(fù)雜，維生素往往要經(jīng)過(guò)提取、皂化衍生化等步驟，且不同的維生素往往前處理方法不同，不具備高效快速的特點(diǎn)。

1.3 毛細(xì)管電泳法

高效毛細(xì)管電泳法起步于20世紀(jì)80年代末，是近年來(lái)發(fā)展最快的分析方法之一。它是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離分析的液相分離方法。

毛細(xì)管電泳法具有高效、快速、分析對(duì)象廣的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)有許多學(xué)者利用其對(duì)水溶性維生素進(jìn)行了測(cè)定?？略聥傻萚10]建立了高效毛細(xì)管電泳同時(shí)測(cè)定5種水溶性維生素的方法，該方法在6 min內(nèi)可以對(duì)5種水溶性維生素進(jìn)行分離，以出峰時(shí)間進(jìn)行定性、峰面積進(jìn)行定量，對(duì)食品中的維生素進(jìn)行定性定量分析。尤慧艷[11]采用毛細(xì)管電泳法對(duì)常見(jiàn)的8種水溶性維生素的快速分離分析電泳條件作了比較深入的探討，通過(guò)雙模對(duì)接高壓電源，實(shí)現(xiàn)了40 kV以上的超高壓，并通過(guò)優(yōu)化其它條件，保證了系統(tǒng)穩(wěn)定性，在2.2 min內(nèi)成功地分離了維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素C、維生素B5、生物素，煙酸和葉酸8種水溶性維生素，為研究水溶性維生素的檢測(cè)方法提供了新思路。但毛細(xì)管由于其直徑較小，所以檢測(cè)時(shí)靈敏度相對(duì)較低；電滲也會(huì)受到樣品成分的影響，重現(xiàn)性不好。

1.4 液相色譜法

色譜分析是按物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相間分配系數(shù)的差別而進(jìn)行分析、分離的方法，相較于傳統(tǒng)的分析測(cè)試方法，色譜法有著更短的檢測(cè)時(shí)間，更高的檢測(cè)效率，更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)[12]。高效液相色譜用高壓輸液系統(tǒng)，以液體為流動(dòng)相，將具有極性不同的單一溶劑或者比例不同的混合溶液等流動(dòng)相輸送入裝有固定相的色譜分析柱，在柱內(nèi)進(jìn)行分離分配，進(jìn)入合適的檢測(cè)器完成對(duì)試樣的分析測(cè)試，其較普通液相色譜具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點(diǎn)，且色譜柱可反復(fù)使用，樣品在短時(shí)間內(nèi)可以回收[13]。

水溶性維生素是維持人體生命活動(dòng)必不可少的重要化合物之一，與人體的健康機(jī)能息息相關(guān)，高效液相色譜法是目前測(cè)定水溶性維生素最普遍的方法，國(guó)內(nèi)外已有許多方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。任丹丹等[14]建立了同時(shí)測(cè)定食品中9種維生素的高效液相色譜分析方法，該方法能同時(shí)對(duì)維生素C、硫胺素、核黃素、煙酰胺、吡哆醇、泛酸、生物素、葉酸和氰鈷胺9種水溶性維生素進(jìn)行檢測(cè)，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 7～0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%～1.35%，檢出限范圍為3 ng/mL～45 ng/mL，加標(biāo)回收率為90.6%～105.4%。郭建博等[15]建立一種快速測(cè)定10種水溶性維生素的超高液相色譜的檢測(cè)方法，該方法能夠在10 min內(nèi)完成10種水溶性維生素的測(cè)定，10種水溶性維生素在該方法下線性關(guān)系良好（r＞0.999），精密度（relative standard deviation，RSD）值小于2%。Saad等[16]建立了快速測(cè)定多種食品中水溶性維生素的方法，該方法成功地應(yīng)用于7種水溶性維生素的混合物的分析，平均回收率為98.14%～100.96%。用液相色譜對(duì)水溶性維生素進(jìn)行檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)高效快速的目的，但在實(shí)際測(cè)定中，還需從維生素本身出發(fā)考慮一些問(wèn)題。

水溶性維生素種類多，不同種類的水溶性維生素其理化性質(zhì)也有很大的差異。不同種類的水溶性維生素在溶液及光、熱、空氣中的穩(wěn)定性見(jiàn)表1。

表1 不同種類的水溶性維生素在溶液及光、熱、空氣中的穩(wěn)定性Table 1 Stability of different kinds of water-soluble vitamins in solution，light，heat and air

林江麗等[17]建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定SO2處理前后無(wú)核葡萄干中4種水溶性維生素的分析方法，結(jié)果表明，用SO2處理對(duì)葡萄干中維生素B1的含量影響最大，其他3種B族維生素的含量變化不大。Kim等[18]建立離子對(duì)試劑測(cè)定和定量動(dòng)物飼料中6種水溶性維生素的方法，表明利用離子對(duì)試劑對(duì)維生素的分離及測(cè)定會(huì)有較大的影響。這些文獻(xiàn)都表明在對(duì)維生素進(jìn)行提取時(shí)應(yīng)注意到提取溶劑可能對(duì)維生素的含量造成一定的影響，要選擇合適的提取溶劑對(duì)維生素進(jìn)行提取，選擇合適的流動(dòng)相對(duì)維生素進(jìn)行分離。

水溶性維生素因其含有如羥基、醛基、共軛雙鍵等生色基團(tuán)，對(duì)紫外光有良好的吸收度。在檢測(cè)中，通常用紫外檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行分析測(cè)定。薛淼等[19]通過(guò)高效液相色譜法在波長(zhǎng)為266 nm下分別測(cè)定了4種茶葉中維生素B1、維生素B2、維生素B3、維生素C和煙酸的含量，為茶葉加工品質(zhì)控制及研究維生素在茶葉加工過(guò)程中的變化提供一種檢測(cè)方法。王雪梅等[20]采用高效液相色譜法在254 nm的波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定了新鮮草莓中維生素C、維生素B1、維生素B2和煙酸的含量，其回收率為96.1%～107.7%，變異系數(shù)為0.912%～1.56%。Rejaul[21]利用紫外檢測(cè)器在13 min內(nèi)分離測(cè)定了8種水溶性維生素，其回歸系數(shù)r＜0.993，精密度0.3%～2.77%，準(zhǔn)確度83%～124%，這些文獻(xiàn)都表明應(yīng)用紫外檢測(cè)器對(duì)維生素進(jìn)行分離測(cè)定具有很大的優(yōu)勢(shì)。水溶性維生素的紫外最大吸收波長(zhǎng)見(jiàn)表2。

表2 水溶性維生素的紫外最大吸收波長(zhǎng)Table 2 Maximum UV absorption wavelength of water-soluble vitamins

當(dāng)然，對(duì)水溶性維生素的檢測(cè)不僅僅局限于紫外檢測(cè)器，許多學(xué)者也用了其他檢測(cè)器對(duì)水溶性維生素進(jìn)行了測(cè)定，Anna等[22]通過(guò)高效液相色譜-光電二極管陣列-熒光法在30 min內(nèi)分離測(cè)定了功能飲料中13種水溶性維生素的含量，以及維生素補(bǔ)充劑的含量。Swen等[23]采用紫外-二極管列陣-熒光法依次對(duì)6種水溶性維生素的含量進(jìn)行了測(cè)定。在維生素的實(shí)際測(cè)定中，不能局限于一種檢測(cè)器，可適當(dāng)應(yīng)用不同的檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

液相色譜法在維生素含量的測(cè)定中作用顯著，在以后的實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)結(jié)合液相色譜的優(yōu)勢(shì)及維生素的理化性質(zhì)開(kāi)發(fā)出更多、更簡(jiǎn)、更優(yōu)的檢測(cè)方法。這對(duì)檢測(cè)維生素的含量、研究不同種類維生素的作用、維生素的提取利用都將有很重要的意義。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用作為近些年出現(xiàn)的一種新的分析檢測(cè)方法，為食品和醫(yī)療等領(lǐng)域的分析檢測(cè)技術(shù)提供了更廣闊的發(fā)展前景。液相色譜-質(zhì)譜分析將色譜的高效迅速和質(zhì)譜的高靈敏度、強(qiáng)定性力有效結(jié)合起來(lái)，可以同時(shí)對(duì)多種不同樣品進(jìn)行定性及定量分析[24-25]。其先利用高效液相色譜對(duì)不同樣品進(jìn)行有效的分離，然后利用質(zhì)譜檢測(cè)器所具有的高專一性、高選擇性、高靈敏度對(duì)不同樣品進(jìn)行分析測(cè)定[26]。Hubo等[27]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定煙草制品中咖啡因、牛磺酸和5種水溶性維生素（維生素B1、維生素 B2、維生素 B3、維生素 B9、維生素 B12）的方法，線性系數(shù)大于0.997，回收率為95.1%～102.8%，該方法可用于批量測(cè)定和檢測(cè)煙草制品中水溶性維生素的含量。施煜等[28]建立液相色譜-質(zhì)譜法快速測(cè)定運(yùn)動(dòng)飲料中維生素B1、維生素B2、泛酸、維生素B6、生物素、葉酸、維生素B12、煙酸、煙酰胺9種水溶性維生素的方法。相關(guān)系數(shù)大于0.999，回收率為90%～102.3%，該方法適用于運(yùn)動(dòng)飲料中維生素的測(cè)定。寧霄等[29]建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法同時(shí)測(cè)定保健食品中10種水溶性維生素，10種水溶性維生素在6 min內(nèi)完成分離，線性相關(guān)系數(shù)大于0.997，回收率為85.9%～109.5%，該方法適用于保健食品中維生素的測(cè)定。水溶性維生素的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 水溶性維生素的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 3 Parameters of water-soluble vitamins by mass spectrometry

液質(zhì)聯(lián)用在實(shí)際使用中會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。基質(zhì)效應(yīng)是指色譜分離時(shí)供洗脫的物質(zhì)改變了待測(cè)成分的離子化效率，從而引起信號(hào)的抑制或提高，很大程度上破壞了結(jié)果的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性。通過(guò)改善樣品前處理方法、改善色譜條件、改善離子化方式、減小進(jìn)樣量等方法可以減小基質(zhì)效應(yīng)。詹越城等[30]建立了食品中牛磺酸、維生素B1、維生素B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維生素B12、生物素12種水溶性維生素含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，該方法較好地減少了基質(zhì)效應(yīng)的影響，有極好的準(zhǔn)確性和高靈敏度。邊麗娜[31]通過(guò)建立一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，對(duì)嬰幼兒配方食品中的11種水溶性維生素進(jìn)行同步檢測(cè)。該方法通過(guò)優(yōu)化色譜條件減少了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室提高食品檢測(cè)效率有著重要意義。

利用液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定水溶性維生素時(shí)應(yīng)通過(guò)不斷優(yōu)化色譜條件、優(yōu)化前處理過(guò)程使水溶性維生素檢測(cè)流程更簡(jiǎn)便、檢測(cè)準(zhǔn)確性更好、檢測(cè)靈敏度更高。

1.6 超臨界色譜法

超臨界流體色譜法也是近年來(lái)發(fā)展較為迅速的一種檢測(cè)方法，以超臨界流體作為流動(dòng)相的一種色譜方法。超臨界流體指的是流體在高于臨界壓力和臨界溫度時(shí)的一種物質(zhì)狀態(tài)，它具有低黏度、高密度及較高的擴(kuò)散系數(shù)等特性。超臨界流體色譜既可以分析氣相色譜法難以處理的高沸點(diǎn)、不揮發(fā)樣品，又有比液相色譜法更高的柱效和更短的分析時(shí)間。理論上講，其應(yīng)用于維生素的定性、定量分析也應(yīng)更加方便。張春蘭等[32]采用超臨界流體色譜快速測(cè)定了復(fù)合維生素中3種維生素含量；線性關(guān)系良好，平均回收率介于97.3%～104.8%。竹宏等[33]利用超臨界流體色譜法建立同時(shí)測(cè)定維生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B64種水溶性維生素的方法，試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出高效、快速，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。這些試驗(yàn)證明了超臨界流體色譜測(cè)定水溶性維生素的可行性，為進(jìn)一步利用超臨界流體色譜測(cè)定水溶性維生素提供了思路。

超臨界色譜應(yīng)用于維生素檢測(cè)時(shí)，相對(duì)于其他方法具有更高的檢測(cè)效率，更短的檢測(cè)時(shí)間，但由于有些水溶性維生素的極性限制難以使用超臨界色譜對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

2 水溶性維生素檢測(cè)方法比較

伴隨現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)的發(fā)展，水溶性維生素檢測(cè)方法也越來(lái)越多樣化。現(xiàn)階段對(duì)水溶性維生素的檢測(cè)主要使用液相色譜法，微生物法和光度法也有使用。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了一些水溶性維生素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，例如在對(duì)食用農(nóng)產(chǎn)品煙酸和煙酰胺的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)中，規(guī)定了微生物法和高效液相色譜法2種方法，其中微生物法的檢出限為50 ng/mL～500 ng/mL，液相色譜法的檢出限為煙酸 30 μg/100 g，煙酰胺為 40 μg/10 g。毛細(xì)管電泳法和超臨界色譜法對(duì)水溶性維生素進(jìn)行檢測(cè)在近些年也多有報(bào)道。不同水溶性維生素檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比見(jiàn)表4。

表4 不同水溶性維生素檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比Table 4 Comparison of advantages and disadvantages of different water-soluble vitamin detection methods

表4對(duì)近年來(lái)水溶性維生素的檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)比，以方便針對(duì)不同檢測(cè)需求選擇合適的檢測(cè)方法。

3 展望

當(dāng)今，人們已經(jīng)越來(lái)越重視健康問(wèn)題，水溶性維生素作為維持人體生命健康的一種極為重要的有機(jī)化合物，已被越來(lái)越多的人關(guān)注和重視。雖然已經(jīng)可以利用液相色譜-質(zhì)譜等方法對(duì)維生素進(jìn)行定性定量分析，但在國(guó)標(biāo)方法中對(duì)維生素的測(cè)定方法還未更新，且沒(méi)有一個(gè)完整有效的包含多種維生素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的更新和拓展應(yīng)作為水溶性維生素檢測(cè)的一個(gè)研究方向。同時(shí)，檢測(cè)的應(yīng)用面也應(yīng)予以擴(kuò)大，將維生素檢測(cè)方法應(yīng)用于飼料、水果、藥品、飲料、發(fā)酵乳制品，以及人體新陳代謝物的研究，這對(duì)食品健康與品質(zhì)的提升，人體健康發(fā)育都有著極其深遠(yuǎn)的意義[34-38]。

近年來(lái)，由于各種高新材料及高新技術(shù)的發(fā)展，全球科學(xué)儀器產(chǎn)生天翻地覆的變化，給分析測(cè)試的發(fā)展帶來(lái)了廣闊的前景，這也意味著水溶性維生素的檢測(cè)方法和手段也將越來(lái)越先進(jìn)。在未來(lái)，采用基因?qū)哟渭夹g(shù)、納米級(jí)材料對(duì)維生素進(jìn)行提取，分子層次的剖析以及全球網(wǎng)絡(luò)的成果共享必然使水溶性維生素的檢測(cè)向更微量、過(guò)程更高效、結(jié)果更精密的方向發(fā)展，也會(huì)使檢測(cè)應(yīng)用面更廣。