三產(chǎn)地百香果葉總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

許夢(mèng)圓，景繼月，韓寶榮，蘭文偉，韋瑋，王文蜀，3*

（1．中央民族大學(xué)民族地區(qū)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；3.中央民族大學(xué)國(guó)家級(jí)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 100081）

百香果（Passiflora edulis Sims）是西番蓮科西番蓮屬多年生草質(zhì)藤本植物，又稱為雞蛋果、西番蓮等[1]，其果實(shí)口感豐富，含有160多種水果的香氣，享有“果汁之王”的美稱[2]，食用后具有美容養(yǎng)顏、減脂瘦身等保健效果[3]。目前百香果加工產(chǎn)品，如果汁、果脯、果醬等越來越被消費(fèi)者喜愛和追捧，經(jīng)濟(jì)效益顯著。此外百香果還具有當(dāng)年種植當(dāng)年掛果，一年中多個(gè)采收期的特性，因此已成為我國(guó)廣西、福建、四川等貧困地區(qū)的脫貧果、致富果[4-5]。

國(guó)內(nèi)外研究表明百香果的果肉可提供多種維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)，而枝葉則富含較多的次級(jí)代謝產(chǎn)物如揮發(fā)油、生物堿、三萜類和以槲皮素、牡荊素、木犀草素、芹菜素等為主的黃酮類成分[6-8]。這些成分具有預(yù)防癌癥、抗氧化衰老、殺菌消炎等功效，特別是黃酮類成分能夠清除人體過多的自由基，減輕機(jī)體氧化損傷，起著延年益壽，保持機(jī)體健康狀態(tài)的作用[9]。與合成抗氧化劑相比，來自植物的黃酮類天然抗氧化劑副作用少，因此其作為外源性抗氧化劑的應(yīng)用被廣泛關(guān)注[10]。

隨著我國(guó)百香果種植加工產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大，每年將產(chǎn)生大量果葉，而果園將果葉收集后一般做法是直接丟棄或堆埋[11]，這在一定程度上嚴(yán)重浪費(fèi)了其中的次級(jí)代謝產(chǎn)物資源。已有文獻(xiàn)報(bào)道百香果根、葉具有消炎止痛、降壓、降血糖、治療失眠和治療焦慮等傳統(tǒng)功效[12-13]，如果將其用于功能性食品開發(fā)、食品添加劑開發(fā)、化妝品行業(yè)等，將極大促進(jìn)百香果產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物中的天然小分子化合物的開發(fā)利用[14]。

已有學(xué)者優(yōu)化了單產(chǎn)地百香果葉總黃酮提取工藝[15]，但對(duì)于不同產(chǎn)地百香果葉總黃酮含量和活性的比較鮮有報(bào)道，而地域環(huán)境、氣候、降水等因素會(huì)使植物中化合物含量及活性產(chǎn)生差異[16]，故本試驗(yàn)選擇我國(guó)百香果主產(chǎn)地廣西北流、福建南平和四川涼山的果葉為試驗(yàn)材料，采用正交設(shè)計(jì)的方法對(duì)其中總黃酮進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，并考察其體外抗氧化活性，為增加天然抗氧化劑的優(yōu)良來源，更為我國(guó)百香果產(chǎn)品的全面開發(fā)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫皮百香果葉：分別于2019年3月采自廣西北流、福建南平和四川涼山百香果種植園。無水乙醇、無水甲醇（均為分析純）：現(xiàn)代東方（北京）科技發(fā)展有限公司；鹽酸、醋酸鈉、冰醋酸、氯化鐵（均為分析純）：北京化工廠；三氯化鋁（純度99%）：ACROS Organics公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，純度96%）：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；蘆丁（純度98%）、三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ，純度98%）：上海源葉生物科技有限公司；二丁基羥基甲苯 （butylated hydroxytoluene，BHT，純度98%）：上海麥克林公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國(guó)Corning公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速粉碎機(jī)（600Y）：永康市鉑歐五金制品有限公司；電子分析天平（BT224S）：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超聲波清洗器（KQ5200E）：昆山市超聲儀器有限公司；精密數(shù)顯恒溫水浴鍋（J-HH-6A）：上海勝衛(wèi)電子科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-215）、循環(huán)水式真空泵（MZX-D）：北京精銳澤祥實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)（V-750）：日本分光株式會(huì)所；EnSpire酶標(biāo)儀：美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 百香果葉前處理及總黃酮提取

新鮮無腐爛的紫皮百香果葉用蒸餾水清洗，置于陰涼通風(fēng)處陰干，收集陰干的樣品，粉碎，過60目篩，備用。

準(zhǔn)確稱取樣品4 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入不同濃度乙醇，經(jīng)超聲萃取后，85℃水浴提取90 min。所得提取液進(jìn)行抽濾和旋蒸處理，后置于通風(fēng)櫥吹干，得到總黃酮浸膏。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

1.3.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用調(diào)整后的比色法[17]繪制曲線，稱取10 mg蘆丁用70%乙醇定容至10 mL容量瓶中，得1 mg/mL蘆丁母液，分別吸取蘆丁母液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于5 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至5 mL，再分別移取不同濃度的蘆丁溶液0.2 mL，及0.25 mol/L的AlCl3溶液0.8 mL于10 mL具塞比色管，用高純水定容至10 mL，搖勻，靜置30 min后，在273 nm處分別測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 百香果葉總黃酮含量測(cè)定

將樣品總黃酮浸膏分別配制一定的濃度，移取0.5 mL樣品于10 mL具塞比色管中，加入0.25 mol/L AlCl3溶液0.8mL，用高純水定容至10mL，在273 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算得到樣品的總黃酮含量，結(jié)果用每克百香果葉（干重）含有的蘆丁當(dāng)量表示，即為mg RT/g DW。

1.3.3 百香果葉總黃酮超聲輔助提取單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 液料比對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響

固定乙醇含量60%，超聲時(shí)間20 min，液料比分別取 30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g），按照 1.3.1 和1.3.2中的方法進(jìn)行廣西百香果葉總黃酮的提取和總黃酮含量測(cè)定。研究不同液料比與百香果葉總黃酮含量的變化關(guān)系。

1.3.3.2 超聲時(shí)間對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響

固定乙醇含量 60%，液料比 60∶1（mL/g），超聲時(shí)間分別取 10、15、20、25、30 min，按照 1.3.1 和 1.3.2 中的方法進(jìn)行廣西百香果葉總黃酮的提取和總黃酮含量測(cè)定。研究不同超聲時(shí)間與百香果葉總黃酮含量的變化關(guān)系。

1.3.3.3 乙醇含量對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響

固定液料比 60∶1（mL/g），超聲時(shí)間 25 min，乙醇含量分別取 20%、40%、50%、60%、70%，按照 1.3.1和1.3.2中的方法進(jìn)行廣西百香果葉總黃酮的提取和總黃酮含量測(cè)定。研究不同乙醇含量與百香果葉總黃酮含量的變化關(guān)系。

1.3.4 百香果葉總黃酮超聲輔助提取正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，選取液料比、超聲時(shí)間、乙醇含量的3個(gè)水平，并以總黃酮含量為正交試驗(yàn)結(jié)果考察指標(biāo)，進(jìn)行提取條件的進(jìn)一步優(yōu)化。因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 不同產(chǎn)地百香果葉體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Polatoglu等[18]的方法，并根據(jù)樣品稍作調(diào)整，配制0.1 mmol/L的DPPH工作液，及0.25 mg/mL～0.80 mg/mL濃度梯度的樣品溶液。分別吸取100 μL不同濃度的樣品或BHT和100 μL的DPPH工作液加入96孔板中，混勻，室溫25℃避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測(cè)定吸光度值。將不同濃度BHT代替樣品，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)將甲醇代替樣品，作為空白對(duì)照，測(cè)定其吸光度值，試驗(yàn)均重復(fù)3次。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為樣品的吸光度；A2為樣品空白（甲醇＋樣品溶液）的吸光度。

1.3.5.2 鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定

參照 Ozgen 等[19]，Kheirkhah 等[20]的方法，分別配制300 mmol/L的乙酸緩沖液（pH3.6），10 mmol/L的TPTZ溶液，20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液，并按照體積比 10∶1∶1混合得到 FRAP 工作液。配制 50 μmol/L～800 μmol/L梯度的FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸取20 μL該溶液與180 μLFRAP工作液加入96孔板中混合均勻，37℃避光反應(yīng)30 min后，于593 nm處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用樣品代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別測(cè)定樣品吸光值，其對(duì)應(yīng)濃度與樣品濃度的比值為FRAP值，用每克百香果葉（干重）含有的亞鐵離子當(dāng)量表示其還原能力，即 μmol Fe2＋/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics軟件處理與分析，采用Microsoft Excel 2019和GraphPad Prism軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.046 3x＋0.098 8，R2=0.999 1，表明在 0.8 μg/mL～4.8 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve line of rutin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料比對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響

液料比對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響如圖2所示。

由圖2可知，百香果葉總黃酮含量隨著液料比的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)液料比達(dá)到60∶1（mL/g）時(shí)，總黃酮含量最高，為10.78 mg RT/g DW，隨后總黃酮含量稍有減少，這可能是因?yàn)榍捌谔崛∪軇┎蛔悖桃航佑|面積較少，得到總黃酮較少，而后過量的提取溶劑又抑制了總黃酮的提取[21]。因此選擇液料比50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）這 3 個(gè)水平，繼續(xù)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 液料比對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids in P.edulis Sims leaves

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響

超聲時(shí)間對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on total flavonoids in P.edulis Sims leaves

由圖3可知，百香果葉總黃酮含量隨著超聲時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐漸增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，總黃酮含量最高，為11.32 mg RT/g DW，超聲25 min后，黃酮化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)可能由于長(zhǎng)時(shí)間的空化作用和機(jī)械振動(dòng)被破壞，造成提取的總黃酮減少[22]。因此選擇20、25、30 min這3個(gè)水平繼續(xù)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 乙醇含量對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響

乙醇含量對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響如圖4所示。

由圖4可知，30%～60%的乙醇含量下，百香果葉總黃酮含量變化不明顯，當(dāng)乙醇含量大于60%后，總黃酮含量急劇減少。這可能是由于提取溶劑乙醇的濃度增加，溶劑極性降低，導(dǎo)致某些物質(zhì)發(fā)生沉淀，造成總黃酮含量下降[23]。因此選擇50%、60%、70%這3個(gè)水平繼續(xù)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 乙醇含量對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on total flavonoids in P.edulis Sims leaves

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及驗(yàn)證

按照正交表，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化百香果葉總黃酮提取工藝，結(jié)果見表2。

表2 百香果葉總黃酮含量正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment for total flavonoids content in P.edulis Sims leaves

由表2可知，影響百香果葉總黃酮含量的因素主次為B＞A＞C，即超聲時(shí)間＞液料比＞乙醇含量。最佳提取方案為 A3B3C1，即液料比 70∶1（mL/g），超聲時(shí)間 30 min，乙醇含量40%。

采取最佳提取條件，重復(fù)3次提取廣西北流百香果葉總黃酮，測(cè)得總黃酮含量平均值為11.55mgRT/gDW，均高于9組正交試驗(yàn)結(jié)果，且與乙醇提取法[15]相比，本提取方法的總黃酮含量增加，表明該工藝具有可靠性。同時(shí)以最佳工藝提取福建南平和四川涼山的百香果葉總黃酮，計(jì)算其總黃酮含量，結(jié)果如表3所示。

表3 百香果葉總黃酮含量Table 3 Total flavonoids content in P.edulis Sims leaves

2.4 抗氧化活性結(jié)果

2.4.1 百香果葉對(duì)DPPH·清除能力測(cè)定

三產(chǎn)地百香果葉總黃酮對(duì)DPPH·清除能力見圖5。

圖5 百香果葉DPPH·清除能力Fig.5 Scavenging ability of total flavonoids in P.edulis Sims leaves on DPPH·

由圖5可知，DPPH·清除率隨著三產(chǎn)地樣品與陽(yáng)性對(duì)照BHT濃度的增加而增加，且三產(chǎn)地樣品濃度在0.80 mg/mL后的DPPH·清除能力與BHT相差不大，鄒江冰等[24]也發(fā)現(xiàn)百香果葉對(duì)DPPH·具有清除能力。四川涼山的百香果葉總黃酮在0.20 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率已經(jīng)達(dá)到了50%以上，表現(xiàn)了在3個(gè)產(chǎn)地樣品中相對(duì)較強(qiáng)的DPPH·清除能力，而廣西北流的樣品則相對(duì)較弱。以上結(jié)果說明三產(chǎn)地百香果葉總黃酮具有DPPH·清除能力，且不同產(chǎn)地樣品具有差異性。

2.4.2 百香果葉亞鐵離子還原能力測(cè)定

以 Fe2＋標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6。標(biāo)準(zhǔn)方式為y=0.980 2x＋0.062，R2=0.999 1，表明在 0.05 mmol/L～0.8 mmol/L線性關(guān)系良好。

圖6 Fe2+標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve line of Fe2+

在FRAP試驗(yàn)中，通過Fe2＋濃度來反映抗氧化能力，所得數(shù)值越大說明其抗氧化能力越強(qiáng)。三產(chǎn)地樣品的亞鐵離子還原能力見表4。

表4 百香果葉亞鐵離子還原能力Table 4 Fe2+reduction ability of total flavonoids in P.edulis Sims leaves

如表4所示，三產(chǎn)地樣品中，四川涼山樣品抗氧化能力最強(qiáng)，數(shù)值約為 78.11 μmol Fe2＋/g，廣西北流樣品FRAP值最低，顯示最弱的亞鐵離子還原能力。

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助乙醇提取法，分別考察了液料比、超聲時(shí)間和乙醇含量對(duì)百香果葉總黃酮含量的影響，在單因素的基礎(chǔ)上采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化百香果葉總黃酮提取工藝。最佳提取工藝：液料比 70∶1（mL/g），超聲時(shí)間 30 min，乙醇含量 40%，在此條件下廣西北流、福建南平和四川涼山的百香果葉總黃酮含量分別為11.55、13.67、14.86 mg RT/g DW，同時(shí)體外抗氧化試驗(yàn)表明，三產(chǎn)地百香果葉有不同的抗氧化能力，其中四川涼山樣品抗氧化能力最強(qiáng)，福建南平次之，這可能與其總黃酮含量具有一定的相關(guān)性，但仍需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步探究作用機(jī)制，以明確總黃酮含量與抗氧化活性的關(guān)系。

百香果口感獨(dú)特，味美多汁，備受人們青睞，其副產(chǎn)物百香果葉是黃酮類化合物的重要來源，但在整體產(chǎn)業(yè)加工過程中，果葉卻被堆埋，造成了天然化合物的浪費(fèi)。本研究證明百香果葉中確實(shí)存在較豐富的黃酮類化合物，并顯示出抗氧化活性，且因地理位置的不同三產(chǎn)地樣品總黃酮含量和抗氧化活性均存在差異。研究結(jié)果對(duì)高效利用百香果天然植物資源，合理開發(fā)功能性產(chǎn)品具有一定的意義，符合當(dāng)今綠色食品、持續(xù)發(fā)展的要求。