添加中草藥對(duì)發(fā)酵TMR化學(xué)成分、微生物組成及發(fā)酵品質(zhì)的影響

■王 妍 江 迪 李榮榮 鄭猛虎 崔欣雨 徐春城

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

發(fā)酵TMR，是根據(jù)家畜不同生產(chǎn)階段的營(yíng)養(yǎng)需要和飼料原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的日糧配方，采用高密度成型、拉伸膜裹包技術(shù)，經(jīng)過(guò)乳酸菌（LAB）發(fā)酵調(diào)制而成的一種營(yíng)養(yǎng)平衡的日糧[1]。發(fā)酵TMR不僅能夠有效保存TMR的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)還可以增加其附加價(jià)值，發(fā)酵還提高了TMR 的貯藏性和有氧穩(wěn)定性，便于工業(yè)化生產(chǎn)和商品化流通。

中草藥源于自然，是一種可以用來(lái)替代化學(xué)類(lèi)飼料添加劑的天然藥物[2]。中草藥中存在許多有效成分，如類(lèi)黃酮、多糖等[3]，這些活性成分可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種致病菌的生長(zhǎng)[4]。李鼎等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩對(duì)無(wú)乳鏈球菌有較好的抑菌效果，當(dāng)歸和茯苓對(duì)LAB有促進(jìn)作用[6]。也有研究表明，在反芻動(dòng)物飼料中添加中草藥，不僅可以改善飼料適口性，促進(jìn)采食量，而且對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、機(jī)體免疫力、產(chǎn)奶性能和改善熱應(yīng)激等都有積極作用[7-10]。Ni 等[11]將黃芪渣和山楂渣添加在苜蓿中青貯，提高了青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。蔣蘇蘇等[12]將中藥渣添加到全株玉米中青貯，發(fā)現(xiàn)添加5%黨參對(duì)青貯品質(zhì)改善效果較好。然而，目前為止中草藥應(yīng)用于發(fā)酵TMR的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在探討添加當(dāng)歸、黃芩、茯苓三種中草藥對(duì)TMR化學(xué)成分、微生物組成以及發(fā)酵品質(zhì)的影響，為中草藥作為發(fā)酵TMR的添加劑提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苜蓿干草來(lái)源于北京市農(nóng)林科學(xué)院北京草地與環(huán)境研究發(fā)展中心，由第二茬紫花苜蓿晾曬而得。豆?jié){渣取自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生食堂。中草藥購(gòu)自北京同仁堂。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將苜蓿干草、玉米粉、新鮮豆?jié){渣、豆粕、預(yù)混料、食鹽按照DM 36∶25.5∶21∶12∶5∶0.5的比例混合調(diào)制TMR。設(shè)置4個(gè)處理組，分別添加2%的無(wú)菌水（T1）、2%的當(dāng)歸（T2）、2%的黃芩（T3）、2%的茯苓（T4）。其中，T1組作為對(duì)照組。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 中草藥添加劑的制作與處理

中草藥各取10 g 加入100 mL 純化水，放入4 ℃冰箱浸提24 h。以文火煮沸30 min，過(guò)濾后繼續(xù)加100 mL純化水，文火煮沸30 min后，再次過(guò)濾。將兩次過(guò)濾后藥液混合，再在文火上濃縮至10 mL，即為100%中草藥原液，滅菌后放入4 ℃冰箱備用[13]。每種中草藥各制備100 mL原液。

1.4 發(fā)酵TMR調(diào)制

根據(jù)配方與試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將原料與中草藥添加劑充分混合均勻，取300 g裝入青貯袋內(nèi)，用真空包裝機(jī)抽真空并封口。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。室溫條件下發(fā)酵0、7、14、28、56 d后開(kāi)封。

1.5 化學(xué)成分、微生物組成及發(fā)酵品質(zhì)分析

1.5.1 化學(xué)成分

每袋發(fā)酵TMR樣品開(kāi)封后，充分混勻，稱(chēng)取樣品約150 g，65 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干48 h，并粉碎過(guò)1 mm篩裝入自封袋，制得干樣。DM采用烘干法，粗蛋白質(zhì)（CP）采用凱式定氮法，中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）采用范式纖維法[14]，可溶性碳水化合物（WSC）采用蒽酮-硫酸比色法[15]測(cè)定。

1.5.2 微生物計(jì)數(shù)

每袋發(fā)酵TMR樣品開(kāi)封后，將樣品充分混勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g樣品裝入無(wú)菌自封袋中，加入90 mL無(wú)菌去離子水，用均質(zhì)器處理3 min 后放入4 ℃冰箱浸提2 h，制得浸提液。浸提液一部分進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。好氧細(xì)菌（AB）采用NA培養(yǎng)基（Nissui，日本），30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。LAB采用MRS培養(yǎng)基（Dif?co，美國(guó)），37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 計(jì)數(shù)。酵母菌（Yeast）采用PDA 培養(yǎng)基（Nissui，日本），30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。

1.5.3 發(fā)酵品質(zhì)

浸提液的另一部分用4層紗布過(guò)濾，再用定性濾紙進(jìn)行二次過(guò)濾，用于測(cè)定pH和NH3-N。pH采用pH計(jì)測(cè)定。NH3-N 采用苯酚-次氯酸鈉比色法[16]測(cè)定。取適量的二次過(guò)濾后的浸提液，加入少量陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（Amber lite，Tokyo，Japan）充分振蕩，6 000 r/min離心5 min，用0.22 μm 水相微孔濾膜過(guò)濾后，采用高效液相色譜法（色譜柱：Shodex Rspak KC-811 Col?umn Shimadzu，日本；檢測(cè)器：SPD-M10AVP；流動(dòng)相：3 mmol/L高氯酸；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：50 ℃）測(cè)定LA、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

微生物組成、發(fā)酵品質(zhì)及化學(xué)成分采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics for Windows 21軟件進(jìn)行分析，利用一般線性模型進(jìn)行二因素方差分析（two-way ANOVA），并用Tukey法多重比較檢驗(yàn)差異的顯著性。顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMR發(fā)酵過(guò)程中微生物組成的動(dòng)態(tài)變化（見(jiàn)表1）

表1 TMR微生物組成的動(dòng)態(tài)變化

不同處理、發(fā)酵時(shí)間以及二者間的交互作用對(duì)AB、LAB 有顯著影響（P<0.05）。發(fā)酵前，原料中AB、LAB、Yeast的微生物數(shù)量分別為107、106～107CFU/g FM和103～104CFU/g FM。發(fā)酵7 d時(shí)，AB數(shù)量達(dá)到峰值；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，數(shù)量持續(xù)下降，56 d時(shí)，AB數(shù)量降低到103CFU/g FM，極顯著低于其他時(shí)間（P<0.01）。LAB的數(shù)量始終在較高的水平，發(fā)酵56 d的LAB數(shù)量為108CFU/g FM。發(fā)酵7 d后Yeast的數(shù)量下降至檢測(cè)限以下。發(fā)酵7、14 d時(shí)，T2組AB數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），LAB數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 TMR發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化（見(jiàn)表2）

表2 TMR發(fā)酵品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化

不同處理、發(fā)酵時(shí)間以及二者間的交互作用對(duì)pH有極顯著影響（P<0.01）。不同處理及發(fā)酵時(shí)間對(duì)LA、AA、PA 和NH3-N 含量有極顯著影響（P<0.01）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組發(fā)酵TMR 的pH極顯著下降（P<0.01），LA、AA、PA 和NH3-N 含量極顯著升高（P<0.01），未檢出BA。其中，所有組別的pH 在發(fā)酵前7 d 迅速降低、LA 含量則迅速升高，之后二者均呈緩慢變化趨勢(shì)。發(fā)酵56 d時(shí)，各組pH降到4.6以下，LA含量達(dá)到7.31% DM～8.30% DM。NH3-N占總氮的比例始終保持在4%以下。T2組在7、14、28、56 d的pH，14、56 d的PA含量和7、14、56 d的NH3-N含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），在14、28、56 d的LA含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。T3組在0、7、56 d的pH顯著低于對(duì)照組（P<0.05），在28、56 d的LA含量和56 d的PA含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。T4 組在7、14、28、56 d 的pH 顯著低于對(duì)照組（P<0.05），在28、56 d 的LA 含量和56 d的PA含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

2.3 TMR發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)組成的動(dòng)態(tài)變化（見(jiàn)表3）

表3 TMR發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化

不同處理、發(fā)酵時(shí)間以及二者的交互作用對(duì)WSC含量有極顯著影響（P<0.01）。發(fā)酵時(shí)間極顯著影響DM含量（P<0.01）、顯著影響CP含量（P<0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組WSC含量極顯著降低（P<0.01），特別是發(fā)酵前7 d，各組WSC含量迅速降低；DM含量極顯著下降（P<0.01）、CP 含量顯著升高（P<0.05）；NDF、ADF含量無(wú)顯著性差異（P>0.05）。其中，T2組在7、14、28、56 d的WSC含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），T3組在7、56 d的WSC含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

3 討論

3.1 添加中草藥對(duì)TMR微生物組成的影響

LAB在青貯及發(fā)酵TMR過(guò)程中起著重要的作用，在發(fā)酵前14 d，LAB大量增殖，達(dá)到108～109CFU/g FM，隨后數(shù)量有所下降，最終數(shù)量維持在108CFU/g FM，是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的主要微生物。AB 初始數(shù)量為107CFU/g FM，發(fā)酵14 d 后被抑制，最終達(dá)到103CFU/g FM。Yeast 在發(fā)酵7 d 后處于檢測(cè)限以下。一方面，中草藥可以促進(jìn)LAB發(fā)酵產(chǎn)生LA，使得pH降低，從而抑制不良微生物的生長(zhǎng)。另一方面，中草藥中含有一些活性成分，對(duì)不良微生物也有一定的抑制作用。Ni等[11]研究表明，中草藥在青貯過(guò)程中能夠抑制梭菌、腸桿菌和真菌的生長(zhǎng)。邢冬梅等[17]研究表明，當(dāng)歸揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等均有一定的抑制作用。劉芳等[18]研究表明，當(dāng)歸總黃酮提取液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌具有抑制作用，且抑菌效果明顯。本試驗(yàn)中，發(fā)酵7、14 d 時(shí)，T2 組AB 數(shù)量低于對(duì)照組，LAB 數(shù)量高于對(duì)照組，說(shuō)明添加當(dāng)歸能夠有效促進(jìn)LAB 發(fā)酵并抑制好氧微生物的繁殖。但黃芩和茯苓在本試驗(yàn)中并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑菌效果。李慧[19]研究發(fā)現(xiàn)，大部分茯苓多糖的生物活性利用率極低。印遇龍等[20]報(bào)道，中草藥的傳統(tǒng)提取條件難以將其有效成分完全利用。因此，有效成分的低利用率和低提取率可能是黃芩和茯苓在本試驗(yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異的原因。

3.2 添加中草藥對(duì)TMR發(fā)酵品質(zhì)的影響

本試驗(yàn)中，各組TMR均具有良好的發(fā)酵品質(zhì)，具體表現(xiàn)為較低pH（4.56）、NH3-N 含量（3.13% TN）和較高LA 含量（8.30% DM）。TMR 發(fā)酵前的pH 為6.34～6.58，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)歸、黃芩和茯苓的提取液pH均小于7，偏酸性，因此發(fā)酵前處理組的pH低于對(duì)照組。發(fā)酵7 d 時(shí)，各組pH 迅速下降，達(dá)到4.84～5.02，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH 緩慢下降，最終降至4.6以下。這與Tian等[21]研究結(jié)果相一致。有機(jī)酸含量是評(píng)價(jià)TMR 發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)，其中LA含量直接影響著發(fā)酵品質(zhì)的好壞。NH3-N 的積累通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)和氨基酸降解的指標(biāo)[22]。BA 來(lái)源于梭菌的活動(dòng)[23-24]。經(jīng)過(guò)56 d 發(fā)酵，各組TMR 的LA 含量達(dá)到8% DM，NH3-N占總氮的比例均在4%以下，各組均未檢出BA。這些結(jié)果均表明TMR發(fā)酵良好。

陸銀[25]在苜蓿中添加黃芪和山楂進(jìn)行青貯發(fā)現(xiàn)，添加中草藥的青貯飼料具有更低的pH、NH3-N 含量以及更高的LA含量。本試驗(yàn)中，添加當(dāng)歸、黃芩和茯苓也獲得了同樣的結(jié)果，發(fā)酵56 d后，與對(duì)照組相比，T2、T3 和T4 組的pH 顯著降低，LA 含量顯著升高，表明添加中草藥可以有效改善TMR的發(fā)酵品質(zhì)。值得注意的是，T2組pH最低，LA含量最高，且NH3-N含量低于其他組，發(fā)酵品質(zhì)最好，這可能是當(dāng)歸中的當(dāng)歸多糖及黃酮類(lèi)物質(zhì)抑制了有害微生物繁殖[18]，促進(jìn)了LAB 生長(zhǎng)[6]，從而產(chǎn)生了大量LA、顯著降低pH，減少了TMR 中蛋白質(zhì)的降解，顯著降低了NH3-N 含量。這也與楊富裕等[26]報(bào)道的添加黃芩和當(dāng)歸可有效改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，且添加0.5%的當(dāng)歸可以顯著降低NH3-N含量的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

添加當(dāng)歸、黃芩和茯苓均能顯著促進(jìn)LAB 發(fā)酵，提高LA含量，降低TMR的pH，有效改善TMR的發(fā)酵品質(zhì)。其中，當(dāng)歸處理組的pH 和NH3-N 含量最低，LA含量最高，其作用效果最好。