四川茂縣花椒根腐病病原菌的分離與鑒定

李志克，唐 蓉，黃小琴，張 蕾，張重梅，鮮赟曦，何天偉，周西全，劉 勇，楊瀟湘

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610066；2茂縣林業(yè)和草原局，四川茂縣623200；3營山縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川營山637700）

0 引言

花椒(Zanthoxylum bungeanum)屬蕓香科、花椒屬多年生香料和油料樹種，果實(shí)含有揮發(fā)性油和脂肪，可作食品香料和香精原料，果實(shí)還是調(diào)味佳品，并具有醫(yī)療作用，因此受到了廣泛關(guān)注[1]。在中國四川、陜西、云南、甘肅、貴州、河北、湖北、湖南、安徽等省栽培面積較大，產(chǎn)量高[2]。四川省阿壩藏族羌族自治州茂縣花椒栽培歷史悠久，依托得天獨(dú)厚的岷江干旱河谷氣候條件，形成茂縣大紅袍花椒油重粒大、色澤紅亮、芳香濃郁、醇麻可口的獨(dú)特風(fēng)味，在市場上享有較高聲譽(yù)，已成為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品和茂縣高半山老百姓脫貧奔康的重要農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)[4-5]。然而，花椒樹在生長過程中極易受到病蟲害的侵襲，加之近年來受市場因素的影響，茂縣花椒栽培面積增加，一度陷入粗放管理和掠奪式生產(chǎn)階段，茂縣花椒病蟲害發(fā)生日趨嚴(yán)重。其中，花椒根腐病在茂縣發(fā)生尤為嚴(yán)重，新椒園發(fā)病率為20%左右，成年椒園病株率達(dá)35%以上，且為害程度逐年上升，椒農(nóng)損失巨大。受害花椒根部變色腐爛，有異臭味，根皮與木質(zhì)部脫離，木質(zhì)部呈黑色。地上部分葉形小而色黃，枝條發(fā)育不全，造成大批椒樹死亡，嚴(yán)重影響茂縣花椒的產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至造成毀園[5-6]。此外，該病的頑固性土傳特性，導(dǎo)致新栽植花椒易感菌死亡。老椒園不能繼續(xù)栽植花椒是茂縣花椒產(chǎn)業(yè)難以持續(xù)發(fā)展的一大難題[5]。研究花椒根腐病病原菌的歸屬種類，是科學(xué)有效防控該病害的首要條件。目前關(guān)于花椒根腐病病原鑒定的研究相對較少。1994年，朱天輝和陳第先通過病原分離和致病力測定，分離得到花椒根腐病的致病菌，并對病原菌分生孢子的形狀、大小等形態(tài)特征進(jìn)行觀察測定，首次發(fā)現(xiàn)引起四川漢源花椒根腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)[7]。2006年，李智敏等人亦對云南省昭通市花椒根腐病的病原進(jìn)行分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果表明云南花椒根腐病的致病菌為茄形鐮刀菌(F.solani)，與朱天輝等記載的腐皮鐮刀菌相一致[8]。以上關(guān)于花椒根腐病病原鑒定的研究皆是基于形態(tài)學(xué)觀察的鑒定手段。然而，鐮刀菌屬是一個龐大的屬，其種類繁多，且部分鐮刀菌存在多個?；?，種間形態(tài)學(xué)特征較為接近，僅以形態(tài)特征對鐮刀菌進(jìn)行種類鑒定是不夠準(zhǔn)確的[9]。本研究通過茂縣花椒根腐病病根采集、病原分離和純化、致病力測定，并結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)和延長因子基因序列(tef1)的分子鑒定，準(zhǔn)確確定了茂縣花椒根腐病病原的分類地位，旨在為科學(xué)有效防治茂縣花椒根腐病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病原微生物的分離與純化

花椒根腐病病根樣品采自四川省阿壩州茂縣溝口鎮(zhèn)與疊溪鎮(zhèn)花椒園，并記錄癥狀和拍照。將花椒病根表面土壤清洗干凈后，用刀片將其切成約5 mm×5 mm的病根組織，病原菌的分離方法采用組織分離法。進(jìn)行分離培養(yǎng)。待菌落形成并產(chǎn)孢后采用孢子直接挑取法進(jìn)行病原菌純化得到單孢菌株。將單孢菌株轉(zhuǎn)入PDA試管斜面培養(yǎng)基，置25℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待斜面長滿后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測定

一年生花椒幼苗根系作切傷處理后栽種在滅菌營養(yǎng)土中。將濃度為1×107個/mL病菌孢子懸浮液灌注在花椒根部附近的土壤中，20～ 50天后觀察病情，發(fā)病后再次通過組織分離法分離病原菌，若分離得到的病原物與原接種菌株一致，則確定該病原物為花椒根腐病致病菌，完成柯赫氏法則的驗(yàn)證[8]。

1.3 病原菌形態(tài)觀察

將病原菌置于PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，用直徑為5 mm打孔器打取邊緣菌絲，接種于PDA培養(yǎng)基上，置25℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)、色澤及產(chǎn)孢情況等。在顯微鏡下觀察孢子的類型、大小等特征。

1.4 病原菌的分子鑒定

利用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌的DNA，用引物ITS1/ITS4[10]和EF1/EF2[11]擴(kuò)增根腐病菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)和延長因子基因(tef1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序得到的序列在NCBI進(jìn)行BLAST序列比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下載相似性高的序列，使用采用MEGA7軟件分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒根腐病病害癥狀

對茂縣溝口鎮(zhèn)與疊溪鎮(zhèn)的花椒根腐病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，花椒根腐病在成年椒園中發(fā)生普遍，病株率達(dá)35%以上，其癥狀表現(xiàn)為根部變色腐爛，有異臭酸味，根皮易脫落，皮下木質(zhì)部呈現(xiàn)黑色（圖1A），地上部分的葉片小，葉片部分失綠。為害重時，造成整株植株死亡，極大的影響了茂縣花椒的品質(zhì)及產(chǎn)量。

2.2 病原菌的致病性測定

根據(jù)常規(guī)分離純化法，得到菌落形態(tài)一致的分離物，并通過孢子直接挑取法獲得單孢菌株2020M1。采用盆栽接種法接種菌株2020M1的孢子懸浮液，20天后有傷口的根系開始變黑；30天后花椒地上部分出現(xiàn)萎焉，根系表皮脫落、根部變黑腐爛，與椒園花椒根腐病發(fā)病癥狀相似；40天后在莖桿基部可見病原菌菌絲（圖1B、C），人工接種的花椒根腐病發(fā)病率為100%。對照的花椒苗根部完好，無相應(yīng)病害癥狀（圖1D）。通過對接種發(fā)病的花椒病根進(jìn)行病原分離，得到了與原接種病菌菌落形態(tài)一致的分離物，由此確定該分離菌株與原接種菌株一致，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

圖1 花椒根腐病危害癥狀

2.3 病原菌形態(tài)觀察

花椒根腐病致病菌株在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落呈圓形，菌絲初為灰白色，后為蘭褐色或紫紅色，表面稀疏。大型分生孢子鐮刀形，0～ 3個隔膜，大小為(24.7～ 46.0)μm ×(4.5～ 7.4)μm；小型分生孢子呈腎形，0～ 1個隔膜，大小為(8.4～ 20.6)μm ×(3.2～ 6.5)μm（圖 2）。通過病原菌形態(tài)學(xué)觀察，確定該病原菌屬于鐮刀菌屬(Fusarium)真菌。

圖2 花椒根腐病病原菌形態(tài)特征

2.4 病原菌分子鑒定

利用ITS、tef1基因特異引物對分離得到的根腐病致病菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將測序獲得序列與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析。選取不同種類鐮刀菌的ITS和tef1序列，首位相連，采用MEGA 7軟件分析生成多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。由系統(tǒng)發(fā)育圖可知，茂縣花椒根腐病病原分離物2020M1與腐皮鐮孢菌(F.solani)W5-3、4100、FJAT-31354處于同一分支，親緣關(guān)系最近（圖3）。因此，聯(lián)合花椒根腐病病原菌的菌落形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，將引起茂縣花椒根腐病的病原菌確定為腐皮鐮孢菌(F.solani)。

圖3 基于ITS和tef1序列構(gòu)建的2020M1菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的病原菌種類進(jìn)行

3 討論與結(jié)論

本研究通過觀察四川茂縣花椒根腐病的危害癥狀和病原菌的形態(tài)學(xué)特征，初步確定引起茂縣花椒根腐病的病原菌為鐮刀菌屬(Fusarium)真菌。為進(jìn)一步明確病原，采用ITS、tef1基因特異引物對病原進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，引起茂縣花椒根腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌(F.solani)。

鐮刀菌屬是分布十分廣泛、非常龐大的一個屬，不僅種類繁多、部分鐮刀菌存在多個?；?，以及鐮刀菌種間差異微小，加上鐮刀菌屬真菌在生長過程中形態(tài)變異較大，傳統(tǒng)的花椒根腐病病原菌鑒定方法僅僅依靠病原菌分生孢子的形狀、大小等形態(tài)特征，很難準(zhǔn)確的區(qū)分種類[9,12-13]。而花椒根腐病傳染性和致病性強(qiáng)且不易清除，準(zhǔn)確確定其病原對該病的防控具有重大的意義。近年來，多基因分子鑒定的方法在鐮刀菌種類鑒定上應(yīng)用廣泛，可以準(zhǔn)確分類。目前應(yīng)用于鐮刀菌鑒定常用的基因位點(diǎn)主要有ITS、tef1、β-tubulin、28S rDNA等[14]。如唐貴婷等[15]基于ITS基因序列和tef1基因序列相結(jié)合確定引起重慶南蒼術(shù)根腐病萎蔫病現(xiàn)象的病原菌是腐皮鐮孢菌(F.solani)。曹瑱艷等[16]同樣依據(jù)ITS基因序列和tef1基因序列相結(jié)合，確定厚垣鐮刀菌(F.chlamydosporum)為浙江省金華市武義縣鐵皮石斛根腐病的主要致病菌。朱孟烽等[9]采用ITS、tef1、βtubulin和28S rDNA四個基因位點(diǎn)證實(shí)咖啡腐皮鐮孢黑果病病原菌為(F.solani)。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察為輔助、結(jié)合ITS和tef1基因序列的分子鑒定，構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，最終準(zhǔn)確確定引起茂縣花椒根腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌(F.solani)。

花椒根腐病病原菌的分離與準(zhǔn)確鑒定為該病害的防控提供了理論基礎(chǔ)，但花椒根腐病的發(fā)生流行規(guī)律、病原菌的生物學(xué)特性和侵染循環(huán)等是開展監(jiān)測預(yù)警及其有效防控的前提條件，還需進(jìn)一步研究明確。此外，腐皮鐮孢菌寄主范圍廣泛，除了造成多種植物的根腐病[15]、莖腐病[17-18]外，還可以侵染引起咖啡[9]、桃子[19]和香蕉[20]等的果腐病，造成芒果[21]、茶葉[22]、刺桐[23]等的葉斑和枯萎病。本研究鑒定的花椒根腐病病原菌株2020M1的寄主范圍如何，是否也可侵染其他植物，造成根腐病、果腐病等病害？還得進(jìn)一步研究，以便為病害的進(jìn)一步防控和植物合理布局提供依據(jù)。

綜上，本研究通過對采自四川茂縣的花椒根腐病病根進(jìn)行病原菌分離純化、柯赫氏法則驗(yàn)證、形態(tài)學(xué)觀察與基于ITS和tef1基因序列的分子鑒定相結(jié)合，構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，確定引起茂縣花椒根腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌(F.solani)。