兩種野生大豆不同生育期光合特性及染色體核型比較

田 鑫，鐘 程，羅 歡，李雪飄

（凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州凱里556011)

0 引言

野生大豆(Glycine soja Sieb.&Zucc.)是栽培大豆的近緣野生物種，屬于蝶形花科大豆屬一年生草本植物。野生大豆莖葉可作飼料，種子可食用，全株可入藥，是非常重要的野生資源，在農(nóng)牧業(yè)育種方面也凸顯重要作用[1]。野生大豆因其資源多、分布廣、蛋白含量高、品質(zhì)特異[2]，具有抗逆境脅迫的適應(yīng)能力強(qiáng)、遺傳多樣性豐富，蘊(yùn)藏著多種適應(yīng)各種生態(tài)環(huán)境的獨(dú)特基因資源[3]。野生大豆對(duì)于豐富栽培大豆基因型、種質(zhì)資源創(chuàng)新及遺傳改良方面具有重要作用[4]。但因其粒小、蔓生、易裂莢等的特性一直未能充分開發(fā)利用，葉綠體是葉片光合作用中心，對(duì)干物質(zhì)的積累有重要影響，因此，光合參數(shù)直接影響作物產(chǎn)量[5]，生產(chǎn)上光合作用是影響大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素，光和能力強(qiáng)弱直接關(guān)系到產(chǎn)量和品質(zhì)的積累[6]，通過篩選高光合野生大豆材料是提高大豆光合效率的有效途徑。對(duì)于同一作物不同品種間或同一品種個(gè)體間的光和能力存在差異，Sakoda[7]研究了不同基因型大豆的光合能力，找出了其中光合能力強(qiáng)的品系14。關(guān)于大豆光合特性研究大多集中在栽培品種，遺傳基礎(chǔ)狹窄。近年來通過野生大豆改良大豆品種，已篩選出優(yōu)質(zhì)、抗性強(qiáng)的材料[8]。但是，關(guān)于野生大豆在光合特性方面的研究較少。主要研究關(guān)于野生大豆與栽培品種的雜交后代的光合變化[5,9]或野生大豆在逆境脅迫下對(duì)光合作用產(chǎn)生的影響[10]，除對(duì)野生大豆進(jìn)行光合特性研究之外，在染色體核型上也有一定研究。Ahmad等[11]用數(shù)量統(tǒng)計(jì)方法分析得到野生大豆核型為2n=24m+14sm+2st。Ladizinsky等[12]發(fā)現(xiàn)大豆染色體C帶擁有4種不同帶型。鄭惠玉等[13]發(fā)現(xiàn)野生大豆染色體有4個(gè)隨體現(xiàn)象。鐘珍萍等[14]等發(fā)現(xiàn)3種野生大豆都含有1對(duì)最長染色體隨體。因此，野生大豆染色體帶型種類繁多，結(jié)合黔東南州野生大豆資源，開展該地區(qū)野生大豆染色體核型研究對(duì)深入系統(tǒng)開發(fā)和選育新種質(zhì)提供可靠的理論依據(jù)。本研究以前期收集到的兩份野生大豆為材料，通過光合指標(biāo)的測定，比較不同類型的野生大豆的光合能力強(qiáng)弱，以期獲得較高光合能效的野生大豆材料，為后續(xù)的大豆遺傳改良提供方法和材料基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)根尖染色體核型進(jìn)行比較，對(duì)挖掘作物的親緣關(guān)系和指導(dǎo)后續(xù)雜交育種具有重要意義，為物種進(jìn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料于2017年12月在丁扒山和凱里學(xué)院收集獲得（由黔東南州林業(yè)局高級(jí)農(nóng)藝師王定江鑒定），于2018年3月12日播種于凱里學(xué)院實(shí)驗(yàn)地，整個(gè)生長期進(jìn)行常規(guī)管理。兩種野生大豆外觀形態(tài)差異表現(xiàn)為：丁扒山野生大豆（丁豆）的葉片橢圓、花期為10月上旬至11月上旬、花色為淡紫色、豆莢邊緣褐色絨毛、豆莢光滑；凱里學(xué)院野生大豆（凱豆）葉片為披針形、花期為8月中旬至9月下旬、花小且花色為紫色、豆莢附有褐色絨毛。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量測定方法 使用SPAD-502 Plus測定葉綠素含量，測定方法同光合特性測定。

1.2.2 各生育期光合特性測定 根據(jù)Fehr等[15]提出的大豆生育期鑒定方法，研究其營養(yǎng)期25節(jié)期(V25)、盛花期(R3)、結(jié)莢期(R5)3個(gè)時(shí)期，每個(gè)時(shí)期于晴天上午8:00—18:00選擇生長健壯、長勢一致且無病蟲害植株各3株，在各株的同一部位和同一方向選取3片葉進(jìn)行測定，重復(fù)3次取平均值。每隔2 h測定一次，待數(shù)值穩(wěn)定后記錄其凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、光強(qiáng)(Par)。

1.2.3 光響應(yīng)曲線的測定方法 光響應(yīng)曲線測定采用LI-6400XT紅藍(lán)光源。測定時(shí)間為9:00—14:00，光合有效輻射梯度為2000、1600、1200、800、400、200、100、50、20、0 μmol/(m2·s)。每次測定前矯正 15～ 20 min。CO2濃度為 500 μmol/(m2·s)，記錄 Pn、Ci、Gs、Tr等指標(biāo)。用葉子飄等[116]提出的修正模型對(duì)曲線進(jìn)行擬合。

1.2.4 根尖染色體處理 于8:00—9:00選取長勢良好粗壯無病蟲害的根尖，采用AEG法進(jìn)行處理[17-18]。選取乳白色根尖1 mm左右進(jìn)行展開壓平，用Giemsa染液染色10～ 15 min，烤片1～ 2 min，在OLYMPUS-BX53熒光顯微鏡觀察拍照。核型類型劃分及核型不對(duì)稱系數(shù)計(jì)算分別參照李懋學(xué)[17]和Arano[18]的方法。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析及圖片制作 采用SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用DPS進(jìn)行光合擬合，Photoshop完成作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期葉綠素含量的變化

由圖1可知，兩種野生大豆在營養(yǎng)期(V25)的差異不顯著，在盛花期和結(jié)莢期凱豆的葉綠素含量顯著高于丁豆。且同種野生大豆的不同時(shí)期葉綠素含量也存在顯著差異。丁豆?fàn)I養(yǎng)期與盛花期差異不顯著，結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期，盛花期和結(jié)莢期差異不顯著；凱豆的營養(yǎng)期與盛花期、結(jié)莢期差異顯著，但盛花期和結(jié)莢期無顯著差異且顯著高于營養(yǎng)期。

圖1 兩種野生大豆葉綠素含量比較

2.2 光合速率日變化

由圖2可知，丁豆結(jié)莢期呈先上升后下降的趨勢，營養(yǎng)期和盛花期呈下降趨勢。凱豆?fàn)I養(yǎng)期、盛花期、結(jié)莢期光合速率均呈先上升后下降的趨勢，凱豆3個(gè)時(shí)期光合速率在10:00時(shí)出現(xiàn)峰值，丁豆?fàn)I養(yǎng)期光合速率在10:00時(shí)出現(xiàn)峰值。兩種野生大豆在同一時(shí)間的光合速率差異顯著。在早上8:00時(shí)，丁豆?fàn)I養(yǎng)期與盛花期無顯著差異，營養(yǎng)期和盛花期與結(jié)莢期差異顯著，營養(yǎng)期>結(jié)莢期，凱豆結(jié)莢期、營養(yǎng)期、盛花期的光合速率間差異顯著，結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，且凱豆光合速率顯著高于丁豆光合速率。當(dāng)10:00時(shí)，凱豆光合速率顯著高于丁豆光合速率，凱豆?fàn)I養(yǎng)期與結(jié)莢期差異顯著，且結(jié)莢期>營養(yǎng)期，營養(yǎng)期與盛花期差異不顯著，盛花期與結(jié)莢期差異不顯著。丁豆3個(gè)時(shí)期間差異不顯著。當(dāng)12:00時(shí)，凱豆的3個(gè)時(shí)期光合速率顯著高于丁豆的光合速率，丁豆的盛花期顯著高于營養(yǎng)期和結(jié)莢期。當(dāng)14:00時(shí)，凱豆3個(gè)時(shí)期差異顯著，丁豆盛花期高于營養(yǎng)期和結(jié)莢期。在16:00時(shí)，凱豆和丁豆的盛花期與結(jié)莢期差異不顯著，但兩者與營養(yǎng)期差異顯著。在18:00時(shí)，丁豆的盛花期與結(jié)莢期差異不顯著，兩個(gè)時(shí)期與營養(yǎng)期差異顯著。凱豆的3個(gè)時(shí)期間均存在顯著差異，且盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。

圖2 兩種野生大豆光合速率比較

2.3 氣孔導(dǎo)度日變化

由圖3可知，凱豆結(jié)莢期氣孔導(dǎo)度呈下降趨勢，營養(yǎng)期和盛花期呈單峰曲線，在10:00時(shí)出現(xiàn)峰值。丁豆的營養(yǎng)期氣孔導(dǎo)度呈下降趨勢，盛花期和結(jié)莢期呈單峰曲線，在10:00時(shí)盛花期出現(xiàn)峰值，在12:00時(shí)結(jié)莢期出現(xiàn)峰值。在8:00—18:00時(shí)，凱豆結(jié)莢期顯著高于盛花期和營養(yǎng)期，氣孔導(dǎo)度大小為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期。在8:00時(shí)，凱豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期，同時(shí)也顯著高于丁豆3個(gè)時(shí)期，丁豆?fàn)I養(yǎng)期顯著高于盛花期和結(jié)莢期。在10:00時(shí)，凱豆3個(gè)時(shí)期存在顯著差異，結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，丁豆3個(gè)時(shí)期差異不顯著，凱豆3個(gè)時(shí)期均顯著高于丁豆。在12:00—14:00時(shí)，凱豆3個(gè)時(shí)期差異顯著，結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，丁豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期，營養(yǎng)期和盛花期差異不顯著，其中，凱豆盛花期和結(jié)莢期顯著高于丁豆結(jié)莢期和盛花期。在18:00時(shí)，凱豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期。

圖3 兩種野生大豆氣孔導(dǎo)度比較

2.4 胞間CO2濃度日變化

由圖4可知，凱豆結(jié)莢期的胞間CO2濃度呈下降趨勢，營養(yǎng)期和盛花期的胞間CO2濃度呈先下降后上升的趨勢。丁豆?fàn)I養(yǎng)期呈先下降后上升再下降的趨勢，其盛花期呈下降趨勢，結(jié)莢期呈雙峰曲線。同時(shí)，在8:00時(shí)，凱豆3個(gè)時(shí)期均大于丁豆3個(gè)時(shí)期，兩種野生大豆胞間CO2濃度均為營養(yǎng)期>盛花期>結(jié)莢期。在10:00時(shí)，凱豆盛花期和結(jié)莢期均大于丁豆盛花期和結(jié)莢期；凱豆胞間CO2濃度差異顯著，結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期；丁豆?fàn)I養(yǎng)期和結(jié)莢期差異不顯著，營養(yǎng)期和結(jié)莢期顯著高于盛花期。在12:00時(shí)，凱豆盛花期和結(jié)莢期均大于丁豆盛花期和結(jié)莢期，其結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期，丁豆胞間CO2濃度為營養(yǎng)期>結(jié)莢期>盛花期。在14:00時(shí)，凱豆3個(gè)時(shí)期的胞間CO2濃度均大于丁豆3個(gè)時(shí)期，其大小為營養(yǎng)期>結(jié)莢期>盛花期，丁豆大小為營養(yǎng)期>盛花期>結(jié)莢期。在16:00時(shí)，丁豆大小為營養(yǎng)期>盛花期>結(jié)莢期，凱豆?fàn)I養(yǎng)期和盛花期顯著高于結(jié)莢期。在18:00時(shí)，凱豆?fàn)I養(yǎng)期顯著高于盛花期和結(jié)莢期，丁豆大小為營養(yǎng)期>結(jié)莢期>盛花期。

圖4 兩種野生大豆胞間CO2濃度比較

2.5 蒸騰速率日變化

由圖5可知，兩種野生大豆蒸騰速率均呈先上升后下降的趨勢，凱豆盛花期和結(jié)莢期在14:00時(shí)達(dá)到峰值，營養(yǎng)期在12:00時(shí)出現(xiàn)峰值。在12:00時(shí)丁豆?fàn)I養(yǎng)期和盛花期蒸騰速率最高，在14:00時(shí)結(jié)莢期蒸騰速率最大。在8:00時(shí)，丁豆結(jié)莢期顯著高于凱豆，丁豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期，凱豆盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。在10:00時(shí)，丁豆盛花期顯著低于凱豆，凱豆大小為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，丁豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期。在12:00時(shí)，凱豆盛花期顯著高于丁豆盛花期，其盛花期和結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期，丁豆結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期。在14:00時(shí)，凱豆3個(gè)時(shí)期顯著高于丁豆3個(gè)時(shí)期，兩種野生大豆蒸騰速率均為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期。在16:00時(shí)，兩種野生大豆蒸騰速率均為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。在18:00時(shí)，丁豆大小為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期，凱豆結(jié)莢期顯著高于營養(yǎng)期和盛花期。

圖5 兩種野生大豆蒸騰速率比較

2.6 光響應(yīng)曲線

從表1可知，丁豆?fàn)I養(yǎng)期在0～ 1200 μmol/(m2·s)范圍內(nèi)的光合速率呈上升趨勢，在1200～ 2000 μmol/(m2·s)呈下降趨勢；丁豆盛花期和結(jié)莢期在0～ 1600 μmol/(m2·s)范圍內(nèi)的光合速率呈上升趨勢，在1600～ 2000μmol/(m2·s)范圍內(nèi)呈下降趨勢。在0～ 100 μmol/(m2·s)范圍內(nèi)的光合速率為營養(yǎng)期>結(jié)莢期>盛花期。凱豆的光合速率隨著光照強(qiáng)度的變化而變化，光照強(qiáng)度越強(qiáng)，光合速率越大，但隨著光照強(qiáng)度的增大，光合速率受到抑制，開始呈下降趨勢。光照強(qiáng)度在 2000 μmol/(m2·s)，營養(yǎng)期、盛花期、結(jié)莢期的光合速率均小于1600 μmol/(m2·s)時(shí)的光合速率。

表1 兩種野生大豆光響應(yīng)曲線比較

由圖6a可知，丁豆光合速率為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期，在光照強(qiáng)度為 1600 μmol/(m2·s)均有光抑制現(xiàn)象。由圖6b可知，凱豆光合速率大小盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。營養(yǎng)期、盛花期、結(jié)莢期的光合速率均呈上升趨勢，但在光照強(qiáng)度為2000 μmol/(m2·s)時(shí)，3個(gè)時(shí)期的光合速率均小于光照強(qiáng)度為1600 μmol/(m2·s)的光合速率。

將兩種野生大豆的營養(yǎng)期、盛花期、結(jié)莢期3個(gè)時(shí)期進(jìn)行DPS數(shù)據(jù)擬合，并計(jì)算其光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)、光飽和點(diǎn)(LSP)、最大凈光合速率(Pmax)。通過DPS 7.05擬合得出相應(yīng)的擬合值及參數(shù)，將對(duì)應(yīng)的擬合值作圖及擬合出的參數(shù)分別帶入式(2)、(3)、(4)計(jì)算出LCP、LSP、Pmax結(jié)果如表2所示。

表2 營養(yǎng)期、盛花期及結(jié)莢期的LCP、LSP、Pmax、Rd

結(jié)合圖6和表3可知，當(dāng)光照強(qiáng)度大于光飽和點(diǎn)時(shí)的光照強(qiáng)度時(shí)，野生大豆受到光抑制現(xiàn)象；當(dāng)光照強(qiáng)度小于光補(bǔ)償點(diǎn)時(shí)，野生大豆無法正常光合作用，只能進(jìn)行暗呼吸。凱豆LCP、LSP、Pmax均為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。丁豆Rd為結(jié)莢期>營養(yǎng)期>盛花期，凱豆Rd為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期；丁豆LCP為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)期，LSP和Pmax為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)期。

圖6 丁豆(a)及凱豆(b)光響應(yīng)擬合修正的直角雙曲線模型

通過對(duì)野生大豆染色體中期分裂細(xì)胞的仔細(xì)篩選，挑選出染色體分散情況良好、染色體的數(shù)目完整、形態(tài)清晰的高質(zhì)量染色體照片，且對(duì)所得到的染色體進(jìn)行測量及分析，從而得到染色體的相關(guān)參數(shù)表（表3），根據(jù)染色體參數(shù)（染色體數(shù)、臂比值、不對(duì)稱系數(shù)）可得出野生種的類型。其相關(guān)參數(shù)內(nèi)容包括染色體數(shù)，染色體臂比，類型，及染色體形態(tài)圖（圖7）。兙俥

根據(jù)染色體不同形態(tài)圖（圖7）及染色體核型參數(shù)表3可得出，野生大豆的染色體數(shù)目都為2n=2x=40，從染色體數(shù)目、臂比、不對(duì)稱系數(shù)、最長染色體/最短染色體進(jìn)行分析得出2個(gè)野生種的核型公式2n=22m+16sm+2st，2n=24m+12sm+4st，丁豆和凱豆的核型參數(shù)存在差異，其不對(duì)稱系數(shù)分別為61.93%、64.31%，兩種野生大豆共有24條染色體為中部著絲粒染色體，14條為近中部著絲粒染色體，2條為端部著絲粒染色體。環(huán)境差異越大，不對(duì)稱系數(shù)差異越大，兩種野生大豆的不對(duì)稱系數(shù)差異不大，因此，兩種大豆的生境條件相近。

表3 野生大豆核型比較

圖7 兩種野生大豆染色體形態(tài)圖

3 討論與結(jié)論

野生大豆光合速率日變化呈雙峰曲線，存在“光合午休”現(xiàn)象，是野生大豆自身對(duì)正午強(qiáng)光和高溫等環(huán)境因素的適應(yīng)力，氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度影響植物光合作用和蒸騰作用，兩種野生大豆出現(xiàn)午休現(xiàn)象之后，光合速率均呈下降趨勢。引起光合午休現(xiàn)象的因素主要有生態(tài)因子、生理因子和生化因子[21]，生態(tài)因子是外部因素[22]（包括溫、光、水、氣、肥等的影響），植物本身是受氣孔和非氣孔因素影響，非氣孔因素受葉片自身因素、葉綠素含量、光合酶活性變化的影響[23]，這與吳廷娟[24]的研究結(jié)果一致，本研究主要受氣孔因素影響，由于野生大豆葉片出現(xiàn)反卷現(xiàn)象，胞間CO2濃度降低，導(dǎo)致光合速率降低。當(dāng)光強(qiáng)超過光飽和點(diǎn)之后，發(fā)生光抑制現(xiàn)象，消耗掉自身制造的有機(jī)物。本研究得出，兩種野生大豆的光飽和點(diǎn)(LSP)為1067.6232～ 2000.0000 μmol/(m2·s)，光 補(bǔ) 償 點(diǎn) (LCP)為 8.5143～ 18.1563 μmol/(m2·s)，兩種野生大豆的LSP較高，LCP較低，而陰生植物的LSP在50～ 1000 μmol/(m2·s)，LCP在 20 μmol/(m2·s)[25]，可見，這兩種野生大豆是耐陰植物，凱豆的LSP>丁豆，凱豆屬高光效植物，丁豆LCP為結(jié)莢期>盛花期>營養(yǎng)時(shí)期，LSP為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)時(shí)期；凱豆LCP、LSP均為盛花期>結(jié)莢期>營養(yǎng)時(shí)期。兩種野生大豆在盛花期的光合效能最高，有利于有機(jī)物積累，Pmax在 7.8613～ 19.2078 μmol/(m2·s)，凱豆的羧化效率較高，光合電子傳遞活性高，因此對(duì)CO2的同化效率高，與LSP的結(jié)果一致，光響應(yīng)曲線擬合的結(jié)果均符合修正的直角雙曲線模型與索榮臻等[9]研究結(jié)果一致。

野生大豆的染色體數(shù)目均為2n=2x=40的二倍體這與壽惠霞等[26]結(jié)論一致。兩種野生大豆不對(duì)稱系數(shù)較大，染色體較不對(duì)稱這與鐘珍萍等[27]研究一致。丁豆核型為2B型，凱豆為2C這與王建波等[28]研究存在差異，可能是不同野生種，同時(shí)還受地理環(huán)境的影響。需在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行基因鑒定，判斷是否與王建波的野生大豆是不同種才能確定產(chǎn)生差異的原因。

葉片光合能力的強(qiáng)弱與葉綠素含量有關(guān)[29-30]；植株的葉綠素含量越高，葉片光合能力越強(qiáng)，本研究發(fā)現(xiàn)凱豆的葉綠素含量較丁豆高，凱豆的光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2、蒸騰速率均高于丁豆，因此光和能力較強(qiáng)，光能利用率高。