基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討?yīng)毣顚?duì)軟骨細(xì)胞影響的分子機(jī)制

王松，王雪嬌，鄭森旺，于歡，呂嘉皓，東嬌嬌，張世豪，楊柳

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化和軟骨下骨改變?yōu)樘卣鞯耐诵行躁P(guān)節(jié)疾?。?］。長(zhǎng)時(shí)間發(fā)病會(huì)導(dǎo)致軟骨組織纖顫、變性和碎片化［2－4］，軟骨下骨硬化、骨小梁結(jié)構(gòu)改變［5－6］，滑膜增生［7－8］，滑膜炎［9］和一系列細(xì)胞因子的改變［10－11］，嚴(yán)重甚至可能導(dǎo)致殘疾。近年來(lái)的研究表明，軟骨細(xì)胞的凋亡是骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵因素［4，12］。關(guān)節(jié)軟骨僅僅依靠軟骨細(xì)胞維持細(xì)胞外基質(zhì)，當(dāng)軟骨細(xì)胞大量凋亡時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退化［13］。因此，以抑制軟骨細(xì)胞凋亡為目的的藥物，是骨關(guān)節(jié)炎治療研究的一個(gè)重點(diǎn)。

獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸（Angelica pubes?censMaxim，f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛的作用。研究表明，獨(dú)活的主要活性成分包括揮發(fā)油、香豆素、有機(jī)酸、萜烯、多糖、甾醇等［14］，具有抗炎［15－16］、抗風(fēng)濕［17］、抗氧化［18］和抗腫瘤［19］等作用?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載：“獨(dú)活，主風(fēng)寒所擊，金瘡止痛，賁豚，癇痓，女子疝瘕。久服，輕身、耐老。一名羌活，一名羌青，一名擴(kuò)羌使者。生川谷，被列為上品?！豹?dú)活辛苦微溫，善治伏風(fēng)，除久痹，且性善下行，祛下焦與筋骨間的風(fēng)寒濕邪。獨(dú)活和以獨(dú)活為君藥的復(fù)方被用于治療骨關(guān)節(jié)炎［20－21］，其對(duì)軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制也是重要的研究?jī)?nèi)容［22］，但是獨(dú)活對(duì)軟骨細(xì)胞影響的潛在分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)的篩選藥物中對(duì)某些特定疾病靶點(diǎn)選擇性高的成分，在理論層面觀察藥物對(duì)疾病的干預(yù)和影響，為研究藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制提供研究方向。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法與中藥及復(fù)方多途徑、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制相得益彰，更符合中醫(yī)整體觀和辨證論治理論的指導(dǎo)［23－24］。因此，本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法研究獨(dú)活活性成分對(duì)軟骨細(xì)胞的影響機(jī)制，為今后獨(dú)活的藥理研究和骨關(guān)節(jié)炎的治療，提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫(kù)：TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/），SEA（https：//sea.bkslab.org/），Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），Genecards（https：//www.gene?cards.org/）， String（https：//string－db.org/）， Metascape（http：//metascape.org/），PDB（http：//www.rcsb.org/）。

軟件：在線Venn 圖繪制工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），Cytoscape 3.7.2，AutoDock?Tools－1.5.6，PyMOL。

1.2 方法

1.2.1 獨(dú)活化學(xué)成分的篩選和結(jié)構(gòu)處理

使用TCMSP 檢索獨(dú)活的化學(xué)成分，得到香豆素、揮發(fā)油、有機(jī)酸等成分99 個(gè)。篩選出口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（Druglikeness，DL）≥0.18 的9 個(gè)化學(xué)成分作為獨(dú)活的主要活性成分，并獲得活性化合物的相關(guān)靶蛋白。在Pubchem 網(wǎng)站上獲得獨(dú)活活性成分的2D 化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得相關(guān)靶蛋白。將獨(dú)活活性成分的SMILES 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SEA 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得相關(guān)靶點(diǎn)。將獨(dú)活活性成分的所有相關(guān)靶點(diǎn)整理并保留唯一項(xiàng)，結(jié)果為獨(dú)活活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.2 靶蛋白和通路的篩選與處理

以“chondrocyte”為關(guān)鍵詞從Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選靶蛋白，將得到的結(jié)果與獨(dú)活活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)繪制Venn圖，獲得獨(dú)活影響軟骨細(xì)胞的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2.3 基因富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入獨(dú)活影響軟骨細(xì)胞的潛在作用靶點(diǎn)，輸入物種（Input as species）和分析物種（Analysis as species）均選擇“Homo Sapiens”。最小交疊值（Min Overlap）為3，PValue Cutoff 值為0.01，Min Enrichment 值為1.5，對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO（Gene ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。

1.2.4 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用上述分析獲得的數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 軟件建立“藥物－活性成分－作用靶點(diǎn)－通路網(wǎng)絡(luò)”圖。

1.2.5 獨(dú)活影響軟骨細(xì)胞關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

為了進(jìn)一步研究獨(dú)活對(duì)軟骨細(xì)胞的影響機(jī)制，將相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，研究物種選為“Homo Sapiens”，可信度最小值設(shè)定為0.900，獲得蛋白互作關(guān)系，使用Cytoscape 軟件將相關(guān)數(shù)據(jù)構(gòu)建成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，得到獨(dú)活對(duì)軟骨細(xì)胞影響的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.6 分子對(duì)接分析

將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的獨(dú)活活性化合物與軟骨細(xì)胞的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接分析，獲得其對(duì)接親和力并查看相互作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 獨(dú)活化學(xué)成分的篩選

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，得到符合條件的化學(xué)物9 個(gè)，包括歐前胡素（Ammidin）、異歐前胡素（Isoimperatorin）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）、二氫歐山芹醇乙酯（O－Acetylcolumbianetin）、當(dāng)歸醇D（Angelol D）、當(dāng)歸醇G（Angelol G）、當(dāng)歸素（Angelicone）、［（1R，2R）－2，3－二羥基－1－（7－甲氧基－2－氧代色素－6－基）－3－甲基丁基］3－甲基丁酸酯（［（1R，2R）－2，3－dihydroxy－1－（7－methoxy－2－oxochromen－6－yl）－3－methylbutyl］3－methylbutanoate）和紫花前胡苷（nodakenin）。根據(jù)TCMSP、Swiss Target Prediction和SEA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這9個(gè)化合物進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，整理并保留唯一項(xiàng)后共獲得胺氧化酶（含黃素）（Amine oxidase［flavin－containing］A，MAOA）、乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，ACHE）、β－分泌脢（Beta－secretase 1，BACE1）、細(xì)胞色素 P4501A2（Cytochrome P4501A2，CYP1A2）和芳香化酶（Aromatase，CYP19A1）等342個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 靶蛋白和通路的篩選與處理

以“chondrocyte”為關(guān)鍵詞從Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選靶蛋白，得到獨(dú)活活性成分和軟骨細(xì)胞相關(guān)靶點(diǎn)的共有基因142個(gè)，包括高親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（NTRK1，High affinity nerve growth factor receptor）、誘生型一氧化氮合酶（NOS2，Nitric oxide synthase，inducible）、G 蛋白偶聯(lián)受體激酶－5（GRK5，G protein－coupled receptor kinase 5）、G1/S 特異性Cyclin－E1（CCNE1，G1/Sspecific cyclin－E1）等。Venn圖見(jiàn)圖1。

圖1 獨(dú)活-軟骨細(xì)胞潛在作用靶點(diǎn)Venn圖

2.3 基因富集分析

使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入獨(dú)活影響軟骨細(xì)胞的潛在作用靶點(diǎn)，獲得潛在靶點(diǎn)的GO（Gene ontology）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析結(jié)果見(jiàn)圖2，KEGG 通路的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。得到的生物過(guò)程（Biology Process，BP）條目按照P值大小排名，前十名分別為細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)（cellular response to organonitrogen compound）、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)（cellular response to lipid）、MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控（positive regulation of MAPK cascade）、對(duì)受傷的反應(yīng)（response to wounding）、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附（regulation of cell adhesion）、節(jié)律過(guò)程（rhythmic process）、肽基酪氨酸磷酸化（peptidyl－tyrosine phosphorylation）、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)（response to oxygen levels）、對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）和絲氨酸肽基的改變（peptidyl-serine modification）。細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目按照P值大小排名，前十名分別為細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域（perinuclear region of cytoplasm）、膜區(qū)（membrane region）、受體復(fù)合體（receptor complex）、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)（transferase complex， transferring phosphorus－containing groups）、溶酶體腔（endolysosome lumen）、核包膜（nuclear envelope）、線粒體膜（mitochondrial membrane）、神經(jīng)細(xì)胞體（neuronal cell body）和磷脂酰肌醇3－激酶復(fù)合物（phosphatidylinositol 3－kinase complex）。 分子功能（Molecular Function，MF）條目按照P值大小排名，前十名分別為磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、醇基為受體（phosphotransferase activity，alcohol group as acceptor）、激酶結(jié)合（kinase binding）、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、整聯(lián)蛋白結(jié)合（integrin binding）、激素受體結(jié)合（hormone receptor binding）和前列腺素受體活性（prostaglandin receptor activity）。KEGG通路分析共得到330個(gè)條目，根據(jù)P值大小排名前十名的分別為癌癥通路（Pathways in cancer）、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、Ras信號(hào)通路（Ras signaling pathway）、人T細(xì)胞白血病病毒1感染（Human T－cell leukemia virus 1 infection）、Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）、非酒精性脂肪肝疾?。∟on－alcoholic fatty liver disease）、血清素能性突觸（Serotonergic synapse）、黏附連接（Adherens junction）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）和cGMP－PKG 信號(hào)通路（cGMP－PKG signaling pathway）。

圖2 富集分析結(jié)果

表1 KEGG通路分析結(jié)果

2.4 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

整理上述信息，使用Cytoscape 軟件構(gòu)建“獨(dú)活－化學(xué)成分－靶點(diǎn)－通路－軟骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)”圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖中共包含163 個(gè)節(jié)點(diǎn)，574 條邊，表示活性成分、靶點(diǎn)和通路的相互作用關(guān)系。度值（degree）可以反映節(jié)點(diǎn)的重要性。圖中的化合物按度值排名，最高的是二氫歐山芹醇乙酯，度值為56。其次重要的有當(dāng)歸素、歐前胡素、β－谷甾醇、異歐前胡素、紫花前胡苷、當(dāng)歸醇D、當(dāng)歸醇G 和［（1R，2R）－2，3－二羥基－1－（7－甲氧基－2－氧代色素－6－基）－3－甲基丁基］3－甲基丁酸酯，度值分別為53、37、21、17、16、8、8和8。化合物的詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 獨(dú)活化合物度值信息

圖3 獨(dú)活－化學(xué)成分－靶點(diǎn)－通路－軟骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 獨(dú)活影響軟骨細(xì)胞關(guān)鍵靶點(diǎn)

將獨(dú)活對(duì)軟骨細(xì)胞相關(guān)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，使用Cytoscape 軟件將相關(guān)數(shù)據(jù)構(gòu)建成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。度值越大，節(jié)點(diǎn)的半徑越大，其中三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，Glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA，Vascular endothelial growth factor A）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR，Epidermal growth factor receptor）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC，Proto－oncogene tyrosine－protein kinase Src）、絲裂原激活的蛋白激酶1（MAPK1，Mitogen－activated protein kinase 1）、半胱氨酸蛋白酶－3（CASP3，Caspase－3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白 激 酶（MTOR，Serine/threonine－protein kinase mTOR）、促分裂原活化蛋白激酶激酶－8（MAPK8，Mitogen－activated protein kinase 8）、促分裂原活化蛋白激酶激酶－14（MAPK8，Mitogen－activated protein kinase 14）和前列腺素 G/H 合酶 2（PTGS2，Prostaglandin G/H synthase 2）為排名前十名的關(guān)鍵靶點(diǎn)，是獨(dú)活對(duì)軟骨細(xì)胞影響的重要靶點(diǎn)。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接

獨(dú)活活性化合物為二氫歐山芹醇乙酯，度值為56；其次重要的有當(dāng)歸素、歐前胡素與對(duì)軟骨細(xì)胞影響的重要靶點(diǎn)GAPDH、VEGFA、EGFR 進(jìn)行分子對(duì)接。在PDB 網(wǎng)站上，分別以GAPDH、VEGFA 和EGFR 為關(guān)鍵詞，最終分別選取PDB 編號(hào)為1ihy、6t9d 和6duk 的3 個(gè)晶體蛋白。使用Pymol 軟件將晶體蛋白進(jìn)行去掉多余配體，去水處理，使用AutoDockTools－1.5.6 軟件進(jìn)行加氫，加電荷處理。

使用Autodock 軟件產(chǎn)生格點(diǎn)文件，GAPDH 蛋白的格點(diǎn)（grid）文件坐標(biāo)為：x= 45.681，y= 13.827，z=45.208；VEGFA 蛋白的格點(diǎn)（grid）文件坐標(biāo)為：x=－6.938，y=25.5，z=10.058；EGFR蛋白的格點(diǎn)（grid）文件坐標(biāo)為：x=35.203，y=91.559，z=－63.753。分別將3個(gè)化合物與3個(gè)受體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接親和力見(jiàn)表3，結(jié)果顯示，對(duì)接親和力均小于－5 kcal/moL，表明均具有良好的結(jié)合效果，對(duì)接圖見(jiàn)圖5～7。對(duì)接親和力最優(yōu)的為二氫歐山芹醇乙酯與EGFR的對(duì)接，二氫歐山芹醇乙酯與THR854A 產(chǎn)生H 鍵作用，與LEU788A 產(chǎn)生Pi－sigma 作用，與PHE856A、LEU777A、ALA763A 和LEU858A產(chǎn)生烷基作用。

表3 GAPDH、VEGFA和EGFR與3個(gè)化合物的對(duì)接親和力（kcal/moL）

3 結(jié)論

OA是老年人最常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)炎，其特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨逐漸退化，滑膜炎癥和疼痛，嚴(yán)重者可導(dǎo)致殘疾。關(guān)節(jié)軟骨是一種高度特化的組織，由細(xì)胞外基質(zhì)組成，細(xì)胞外基質(zhì)僅由稀疏分布的常駐細(xì)胞軟骨細(xì)胞合成。軟骨細(xì)胞的存活對(duì)于適當(dāng)?shù)能浌腔|(zhì)的維持非常重要，軟骨細(xì)胞功能和存活的損害將導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨失效［13］。因此，探究藥物對(duì)軟骨細(xì)胞的影響是研究OA治療的重要方向。獨(dú)活具有養(yǎng)血舒筋、祛風(fēng)祛濕、滋補(bǔ)肝腎的作用，以獨(dú)活為主藥的復(fù)方如獨(dú)活寄生湯、加味獨(dú)活寄生合劑對(duì)OA具有良好的治療作用［25－26］。

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，構(gòu)建了獨(dú)活化學(xué)成分－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)－通路圖，得到度值最高的化合物為二氫歐山芹醇乙酯、當(dāng)歸素和歐前胡素。3 種化合物均屬于香豆素類，香豆素是一類以苯并α－吡喃酮為母核的化合物［27］。據(jù)研究，香豆素類化合物具有通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的形成而減少骨質(zhì)的丟失，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖而促進(jìn)骨膠原的合成，有效防治類固醇性骨質(zhì)疏松的作用，同時(shí)具有明顯的抗炎效果［28－29］。香豆素具有鈣離子拮抗劑的作用，可抑制鈣離子經(jīng)鈣通道進(jìn)入細(xì)胞，維持胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度在合適的水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡［25］。這說(shuō)明二氫歐山芹醇乙酯，當(dāng)歸素和歐前胡素可能是獨(dú)活治療OA 的標(biāo)志化合物。

圖6 VEGFA 與二氫歐山芹醇乙酯（A）、當(dāng)歸素（B）和歐前胡素（C）的分子對(duì)接

圖7 EGFR 與二氫歐山芹醇乙酯（A）、當(dāng)歸素（B）和歐前胡素（C）的分子對(duì)接

GAPDH在細(xì)胞內(nèi)含量豐富［30］。當(dāng)細(xì)胞受到NO刺激后，GAPDH 將會(huì)被亞硝基化，與E3 泛素連接酶Siah1結(jié)合，發(fā)生核異位和凋亡［31］。分子對(duì)接的結(jié)果表明，獨(dú)活可能通過(guò)與GAPDH 結(jié)合，抑制GAPDH 的亞硝基化，從而影響軟骨細(xì)胞的凋亡，達(dá)到治療OA 的目的。VEGFA 是一種特異性很高，起著血管再生作用的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。李雪峰［32］等對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者血清和關(guān)節(jié)液中的VEGF 進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明VEGF 在骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。VEGF 可以上調(diào)抑制細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，從而保證軟骨細(xì)胞的存活［33］。獨(dú)活可能通過(guò)對(duì)VEGF 的影響，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，達(dá)到治療OA 的目的。EGFR 信號(hào)系統(tǒng)是骨骼系統(tǒng)病理、生理學(xué)的重要成員［34］。EGFR 與配體結(jié)合后激活Ras，活化的Ras 進(jìn)一步激活Raf，Raf 磷酸化后激活MEK1/MEK2，進(jìn)而活化ERK1 和ERK2，其下游的轉(zhuǎn)錄因子Ets、Elkh 和c－Fos進(jìn)入細(xì)胞核，參與調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖過(guò)程［35］。因此，獨(dú)活可能通過(guò)影響EGFR 的結(jié)合，調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖，進(jìn)而治療OA。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)獨(dú)活可能通過(guò)直接或間接參與軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡，還通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)干預(yù)軟骨細(xì)胞的功能。分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果表明，度值前三名的化合物二氫歐山芹醇乙酯、當(dāng)歸素和歐前胡素與軟骨細(xì)胞的關(guān)鍵靶點(diǎn)GAPDH、VEGFA和EGFR 均具有良好的結(jié)合。本研究闡述了獨(dú)活可能通過(guò)干預(yù)軟骨細(xì)胞治療OA 的作用機(jī)制，但是所得結(jié)論仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。