基于肝臟代謝組學探討冰水浴對大鼠物質能量代謝的影響

張寧，李自輝，葉濤，龐牧，劉樹民*，李玲

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

四性（氣）是中藥藥性理論的重要組成部分，是說明藥物作用的主要理論依據(jù)之一［1］。課題組前期嚴格按照首席科學家匡海學教授提出的中藥性（氣）味科學內涵新假說內容，建立與冰水浴誘導的寒凝血瘀證病理相關的動物寒證模型，基于“寒者熱之，熱者寒之”理論，用于中藥藥性（氣）關鍵科學問題研究［2］。而代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，其研究思想與中醫(yī)藥研究思想的整體觀相似，已廣泛應用于中藥藥性理論研究，這對推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重要作用［3］。近年來研究表明，代謝組學技術可較好探討寒證的科學本質［4－7］。

《靈樞·邪氣藏府病形》中說：“有所墮墜，惡血留內，……積于脅下，則傷肝”。瘀血停于體內，當“惡血歸肝”超越肝本身的“去瘀生新”，即新陳代謝功能的最大限度時，會阻滯氣機，產(chǎn)生傷肝的病理變化。中醫(yī)學認為肝既藏有形之血，又疏泄無形之氣，其中疏泄調暢氣機是其基本功能，貫穿其他功能之中。古人又有“肝主血?！敝f，可見肝與瘀血的形成關系密切。且課題組前期已初步驗證建立的寒凝血瘀大鼠模型具有一定的科學性［2］。故本研究運用肝臟代謝組學技術，探討寒凝成瘀的可能機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級SD 大鼠，雄性，20 只，體質量180～220 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（遼）2015－0001。動物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心的代謝籠中，室內溫度20～25℃，相對濕度40%～60%，12 h避光，12 h光照，自由飲食。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物管理和使用委員會審核，符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》和《實驗動物管理和使用委員會章程》的相關規(guī)定，實驗動物倫理審查批準編號為DWLL20151108001。

1.2 藥物與試劑

乙腈（色譜級，F(xiàn)isher 技術有限公司，美國）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司）；甲酸和亮氨酸腦啡肽（Sig－ma－Aldrich，美國）；細胞色素C 氧化酶（COX）、ATP 合酶（ATPase）、腺苷激酶（ADK）和Na＋－K＋－ATP 酶酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160320）。

1.3 主要儀器

AcquityTMUPLC 液相色譜與Q－TOF－MS 質譜儀（Waters 集團公司，美國）；MassLynxV4.1 工作站（Waters集團公司，美國）；KDC－160HR型高速低溫離心機（科大創(chuàng)新股份公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（Milli－Q公司）；超低溫冰箱（賽默飛世爾科技中國有限公司）；AL204電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；MS3 digital 渦旋儀（德國IKA公司）；Anthos2010酶標儀（奧地利安圖斯公司）。

2 方法

2.1 實驗分組

大鼠隨機分為空白組和寒凝血瘀模型組兩組，每組10只。除空白組外，模型組大鼠置于0～1 ℃冰水中15 min，每日1次，連續(xù)15 d，造成寒凝血瘀模型。

2.2 能量代謝相關指標含量的測定

末次冰水浴24 h 后，將大鼠麻醉，取相同部位肝臟加入9 倍體積4 ℃生理鹽水制備成10%組織勻漿，于4 ℃3 500 r/min 離心10 min，取上清液，根據(jù)酶聯(lián)免疫檢測法，嚴格按照試劑盒說明書操作檢測肝臟組織上清液中COX、ATPase、ADK 和Na+－K+－ATP含量。

2.3 肝臟代謝組學樣本的處理

末次冰水浴24 h后，將大鼠麻醉，取相同部位肝臟加入10倍體積4 ℃甲醇，制備成勻漿，渦旋混勻3 min，于4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清液存于離心管，重復上述條件離心一次，用于代謝組學分析。

2.4 UPLC－MS條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm × 50 mm，i.d.1.7 μm）；進樣量：2 μL；流速：0.4 mL/min；流動相：0.05%甲酸乙腈（A）－0.05%甲酸水溶液（B）；洗脫梯度：2%～40%A（0～8 min），40%～98% A（8～10 min），98%～100% A（10～13 min），100%～2% A（13～14 min），2%A（14～17 min）；柱溫：40 ℃。電噴霧離子源（ESI），源溫度110 ℃，脫溶劑氣流量750 L/h，脫溶劑氣溫度350 ℃。正離子模式下，毛細管電壓1 300 V，樣品錐孔電壓60 V，離子能量35 V；負離子模式下毛細管電壓1 500 V，樣品錐孔電壓70 V，離子能量34 V，質量掃描范圍100～1 500 Da。

2.5 大鼠肝臟樣本潛在標志物的代謝組學分析

MS 數(shù)據(jù)首先導入到Progenesis QI 3.0.3 軟件進行色譜峰匹配、提取、標準化、歸一化等，將正、負離子模式下每個代謝物的m/z、保留時間和離子強度，導入到EZinfo3.0.3 軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）用于觀察每組樣本代謝輪廓是否能夠顯著分開，然后用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal to partial least squares－discriminate analysis，OPLS－DA）表征冰水浴誘導的代謝擾動［8］。通過與EZinfo3.0.3的無縫集成來利用高級的統(tǒng)計數(shù)據(jù)（Umetrics，V 2.0 版）得到展現(xiàn)貢獻度最大變量的S－plots 圖和變量權重值（VIP）。根據(jù)VIP > 1、S－plot 和P< 0.05 選擇冰水浴誘導的寒凝血瘀證的潛在生物標志物。應用HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、KEGG（https：//www.kegg.jp/）以及MetPA（https：//www.metaboanalyst.ca/）數(shù)據(jù)庫對潛在差異代謝標記物進行結構鑒定及代謝通路拓撲分析，闡釋其生物學意義，評價冰水浴對大鼠物質能量代謝的影響。

2.6 數(shù)據(jù)處理

各組實驗數(shù)據(jù)均用SPSS22.0 軟件做統(tǒng)計學處理，結果以±s表示，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間比較用最小顯著差異（LSD）進行檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 冰水浴對正常大鼠能量代謝相關指標的影響

與空白組相比較，模型組大鼠肝臟中COX和Na＋－K＋－ATP 酶的含量顯著性降低（P< 0.05），ATPase 和ADK的含量極顯著性降低（P<0.01）。見表1。

表1 冰水浴對正常大鼠COX、ATPase、ADK、Na+－K+－ATP酶的影響（±s，n=10）

表1 冰水浴對正常大鼠COX、ATPase、ADK、Na+－K+－ATP酶的影響（±s，n=10）

注：與空白組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別空白組模型組COX（ng/mL）1.49±0.12 1.26±0.20▲ATPase（ng/mL）5.19±0.35 4.55±0.33▲▲ADK（ng/mL）2.31±0.33 1.89±0.19▲▲Na+－K+－ATP（gprot/L）7.82±1.94 6.00±1.22▲

3.2 大鼠肝臟代謝總離子色譜圖

應用Marker Lynx XS 對大鼠肝臟樣品的離子峰進行識別與匹配，得到空白組和模型組總離子流色譜圖（TIC）。結果兩組數(shù)據(jù)代謝產(chǎn)物分離，輪廓清晰。見圖1。

圖1 正、負離子模式下空白組和寒凝血瘀證模型組大鼠肝臟代謝TIC圖

3.3 大鼠肝臟數(shù)據(jù)的分析

應用監(jiān)督性3D－PCA 表現(xiàn)大鼠肝臟樣本代謝輪廓的狀態(tài)。結果表明空白組與模型組明顯分開，提示兩組之間存在顯著性差異且造模成功。由S－Plot 圖可知，大多數(shù)代謝產(chǎn)物離子在原點周圍聚集，偏離原點的離子占少數(shù)，說明兩組之間存在差異；經(jīng)VIP> 1 篩選得到VIP－Plot 圖并預選出潛在生物標志物。見圖2。

圖2 正、負離子模式下冰水浴前后各組大鼠肝臟代謝輪廓3D－PCA、S－Plot和VIP－Plot模式識別圖

3.4 大鼠肝臟數(shù)據(jù)的潛在生物標志物

篩選符合VIP > 1 及Fold Change > 1.0 的代謝產(chǎn)物，對空白組與模型組進行比較發(fā)現(xiàn)25 個差異代謝產(chǎn)物（見表2）；經(jīng)過離子強度的比較發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組16 個生物標志物顯著上調（P<0.05），9 個生物標志物顯著下調（P<0.05），見圖3。

圖3 冰水浴對正常大鼠肝臟中潛在生物標志物離子強度的影響

3.5 肝臟中潛在生物標志物的分類

針對被篩選出的潛在生物標志物，根據(jù)HMDB 數(shù)據(jù)庫中所描述的細胞位置、生物功能、生物進程和化學結構進行分類。在細胞位置上，大約53%位于細胞外，41%位于細胞膜，3%位于細胞漿，3%位于溶酶體上；在生物功能上，用于能源、膜穩(wěn)定劑和儲能的各占29%，用于炎癥的占5%，用于藥物代謝物和廢品的各占6%；在生物進程方面，參與脂代謝的占25%，參與脂質轉運的占22%，參與磷脂代謝的占10%；在化學結構上，大約68%的屬于脂肪族無環(huán)化合物，大約16%屬于脂肪族雜環(huán)化合物，大約8%屬于脂肪族同多環(huán)化合物，見圖4。

3.6 肝臟中潛在生物標志物的通路分析

將表2 中被篩選出來的生物標志物通過Meta PA分析，得到8 條相關代謝途徑，見表3。將代謝通路影響值的臨界值> 0.10 確定與所分析物組相關性最強的代謝通路。冰水浴對正常大鼠代謝道路分析圖見圖5，冰水浴主要影響甘油磷脂代謝。

圖5 冰水浴對正常大鼠代謝通路分析圖

表3 利用Meta PA分析冰水浴對正常大鼠的代謝指紋通路

4 討論

4.1 氧化磷酸化過程

在細胞呼吸中處于細胞色素系統(tǒng)末端的細胞色素C 氧化酶（Cytochrome C Oxidase），亦稱細胞色素氧化酶，此酶是通過自動氧化作用把呼吸底物的電子經(jīng)過細胞色素系統(tǒng)直接傳遞給分子態(tài)氧［9］。ATP 合酶（ATPase）又稱為三磷酸腺苷酶，可將三磷酸腺苷（ATP）催化水解為二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根離子，同時釋放能量［10］。在大多數(shù)情況下，能量通過傳遞而被用于驅動另一個需要能量的化學反應，此過程被所有已知的生命形式廣泛利用［11］。鑲嵌于線粒體內膜上的鈉鉀泵又稱鈉泵、鈉鉀ATP 酶（Na＋－K＋－ATP 酶），是維持線粒體膜流動性正常的關鍵酶，若該酶活性下降，損傷線粒體膜正常的流動性，從而造成線粒體功能障礙，導致ATP 合成不足，繼而又使Na＋－K＋－ATP 酶的活性降低，二者相互影響［12］。腺苷參與調控機體的心肌能量代謝、脂肪代謝、免疫反應、炎性反應等一系列生理過程，而腺苷激酶（Adenosine kinase，ADK）在腺苷代謝中起到至關重要的作用，其催化腺苷生成AMP，進而調節(jié)腺苷的濃度，最終參與調控機體的不同生理過程。ADK 可以催化ADP 合成ATP［13］。本研究中，冰水浴抑制COX、ATPase、ADK 和Na＋－K＋－ATP酶的表達，說明冰水浴對于正常大鼠機體的呼吸鏈表現(xiàn)出抑制作用，其抑制氧化磷酸化反應中ATP 生成的機制可能與抑制COX 和ATPase 活性、抑制線粒體Na＋－K＋－ATP酶的功能有關。

4.2 甘油磷脂代謝

脂質是生物膜的骨架成分，既參與生物的生命活動又為生物提供能量的重要物質［14］。磷脂是生物膜的主要結構成分，包括一系列的脂肪酰基和頭部親水性成分，如磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿［15］。本研究中溶血磷脂酸LPA［0：0/18：1（9Z）］、磷脂酰乙醇胺PE（P－18：0/22：6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z））和PC（15：0/18：0）參與甘油磷脂代謝。

迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小、結構最簡單的磷脂是溶血磷脂酸（LPA），主要是由凝血過程中的血小板受到凝血酶活化而釋放入血的，是凝血和血栓形成過程中的重要分子產(chǎn)物［16］。LPA 的含量在一定程度上反映了血瘀證的發(fā)展與轉歸，據(jù)報道LPA與凝血過程密切相關［17］。本研究中，模型組大鼠LPA（0：0/18：1（9Z））水平較正常對照組明顯增加（P<0.05），提示采用動物實驗方法，冰水浴誘導的寒凝血瘀證大鼠模型，顯示模型復制成功。

膽堿通過膽堿激酶催化生成的PC（又稱膽堿磷酸甘油酯）是一種至關重要的生物分子，是磷脂合成的前體。在生物界分布很廣，且有重要的生物功能，有控制動物機體脂肪代謝作用［18］。據(jù)報道，磷脂酰膽堿通過直接影響膜結構使受損的肝功能和酶活力恢復正常，維持肝臟的能量平衡，進而促進肝組織再生，將中性脂肪和膽固醇轉化成容易代謝的形式，穩(wěn)定機體膽汁水平［19］。本研究，模型組大鼠PC（15：0/18：0）水平較正常對照組明顯降低（P<0.05），說明冰水浴通過下調磷脂酰膽堿水平進而降低寒凝血瘀大鼠機體能量代謝。

PE，磷脂質的一種。在動物中，經(jīng)過CDP 乙醇胺和1，2－甘油二酯的反應生成PE。后者經(jīng)磷脂酶A 作用生成溶血磷脂酰乙醇胺［20］。據(jù)報道，在老鼠肝臟中，它與卵磷脂一起在微粒體和線粒體間進行轉移，影響肝細胞膜Na+－Ca2+轉導，影響能量代謝［21］。另外，PE與血液凝固有關，可能是凝血酶激活酶的輔基［16］。本研究中，模型組大鼠PE（P－18：0/22：6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z））水平較正常對照組明顯降低（P<0.05），說明冰水浴可能通過下調PE 水平進一步催化凝血酶產(chǎn)生血瘀反應，同時抑制寒凝血瘀大鼠機體的能量代謝。

4.3 動物模型寒凝血瘀證代謝組學研究

建立相應的寒凝血瘀證動物模型，分析生物樣本，有助于進一步探討寒凝血瘀證科學本質，為臨床診斷和治療奠定實驗依據(jù)。孟憲生等［22］注射大劑量腎上腺素和冰浴誘導氣滯寒凝血瘀模型，基于血漿代謝組學找到其潛在生物標志物及機制。MA等［23］運用冰水浴和注射腎上腺素誘導急性血瘀證，發(fā)現(xiàn)代謝組學和網(wǎng)絡分析技術有助于評價急性血瘀證機制。課題組前期研究［2］發(fā)現(xiàn)，16S rRNA 的高通量基因測序技術與糞便上清代謝組學技術的聯(lián)用可用于評價冰水浴誘導的寒凝血瘀證的病理機制。WU等［24］用冰水浴聯(lián)合皮下注射鹽酸腎上腺素誘導大鼠血瘀證，發(fā)現(xiàn)血清代謝組學可較好的評價血瘀證的病理機制。然而，尚未發(fā)現(xiàn)肝臟代謝組學技術與寒凝血瘀證的相關研究。中醫(yī)學認為，肝乃藏血之臟，肝失疏泄則肝氣郁結，氣滯血瘀可能為寒凝血瘀證病因之一。故從肝臟代謝組學角度出發(fā)，闡明寒凝血瘀證的病理機制為本研究的特色和創(chuàng)新之處。

綜上所述，本研究在傳統(tǒng)生理、生化基礎上，通過肝臟代謝組學分析技術，尋找出25 個具有生物學意義的顯著差異潛在生物標志物，闡明寒凝血瘀的主要代謝通路為甘油磷脂代謝。冰水浴通過影響正常大鼠的能量代謝過程相關指標、肝臟代謝產(chǎn)物和相關潛在代謝通路，抑制機體能量代謝和功能活動，符合寒證特點，為從動物實驗角度驗證匡海學教授中藥性（氣）味科學內涵新假說奠定扎實的實驗基礎，這對中藥藥性理論研究以及推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重要作用。