基于增強(qiáng)拉曼光譜的蘋果中啶蟲脒農(nóng)藥殘留的無損定量分析

彭彥昆，田文健，郭慶輝，趙鑫龍，喬 鑫

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，國家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)裝備研發(fā)分中心，北京 100083）

0 引 言

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的快速發(fā)展，農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)效率不斷提高。在提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時，農(nóng)藥濫用的問題也隨之出現(xiàn)。過量施用農(nóng)藥會導(dǎo)致消費(fèi)者購買的農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重威脅了消費(fèi)者生命健康[1]。又因農(nóng)藥的種類繁多，且殘留量十分微小，給檢測和監(jiān)管增加了難度，因此進(jìn)行農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留新檢測方法的研究具有十分重要的意義。

目前，農(nóng)藥殘留檢測方法主要分為傳統(tǒng)檢測法、生物測定技術(shù)和光譜分析技術(shù)三大類[2-4]。其中，傳統(tǒng)檢測法操作難度高，操作時間長且價格較昂貴，對樣品具有一定的破壞性，無法大面積推廣應(yīng)用[5-6]。拉曼光譜具有指紋效應(yīng)，其光譜的譜峰反映了被測物分子的化學(xué)鍵振動與轉(zhuǎn)動信息，在物質(zhì)檢測方面廣泛應(yīng)用。但拉曼光譜受限于較小的拉曼散射截面，信號強(qiáng)度較弱，無法對農(nóng)作物中的痕量殘留提供準(zhǔn)確的檢測[7]。在粗糙貴金屬納米顆粒之間的局部等離子體共振增強(qiáng)和被測物分子與納米粒子之間的吸附增強(qiáng)的共同作用下，拉曼信號會獲得極大的增強(qiáng)，由此獲得的光譜被稱為表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）[8-11]。同時，SERS光譜還具有檢測快速與特異性好等優(yōu)點，因此被廣泛用于蘋果中各種農(nóng)藥殘留的快速檢測。Kumar等[12]采用SERS技術(shù)結(jié)合快速預(yù)處理方法，實現(xiàn)了蘋果皮中的福美雙殘留的快速檢測，最低檢測限為 2.4×10-9g/cm2，比國標(biāo)規(guī)定降低了 3個數(shù)量級。Mandrile等[13]以不同尺寸的金納米顆粒為增強(qiáng)基底，結(jié)合SERS技術(shù)快速檢測蘋果汁中的嘧霉胺，最低檢測濃度達(dá) 5 mg/L。Tang等[14]利用非平面SERS技術(shù)，檢測蘋果中的毒死蜱和吡蟲啉農(nóng)藥殘留，檢測最低濃度分別為0.01 mg/L和0.05 mg/L。Fu等[15]合成金納米棒陣列和固相萃取凈化技術(shù)快速檢測蘋果中的噻苯咪唑農(nóng)藥，最低檢出限達(dá)到 0.06 mg/L。Hussain等[16]利用雙金屬核殼納米粒子做SERS基底檢測蘋果提取物中的齊拉姆，檢測限達(dá)到0.015 mg/kg。但是，為了實現(xiàn)低濃度農(nóng)藥的準(zhǔn)確檢測，一些樣本在預(yù)處理過程中會被破壞[17-18]。所以在不破壞樣本的前提下能夠滿足農(nóng)藥殘留的國標(biāo)檢測要求，可以通過提高增強(qiáng)基底的性能來實現(xiàn)。SERS增強(qiáng)的機(jī)理可以用電磁機(jī)理和化學(xué)機(jī)理來說明。電磁機(jī)理是占主導(dǎo)地位的，因為化學(xué)機(jī)理僅對單分子產(chǎn)生10～104倍的增強(qiáng)，而電磁機(jī)理則給出108甚至更多的增強(qiáng)[19-20]。據(jù)資料顯示[21-22]，銀納米粒子是用于拉曼信號增強(qiáng)的最有效金屬粒子，SERS增強(qiáng)因子是金納米粒子的 10～100倍。蘋果農(nóng)藥多為酸性，采用銀溶膠檢測蘋果表面農(nóng)藥殘留時適當(dāng)控制銀溶膠的 pH值對提高檢測結(jié)果的穩(wěn)定性具有重要的意義。

本文以改進(jìn)的銀溶膠為增強(qiáng)基底，以蘋果中的啶蟲脒農(nóng)藥為研究對象，在不破壞樣本的前提下將銀溶膠滴加到蘋果上采集光譜，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法[23-24]不僅滿足了國標(biāo)要求的蘋果中啶蟲脒殘留檢出限要求，還實現(xiàn)了量化分析。希望通過本研究為農(nóng)產(chǎn)品安全檢測提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

采用實驗室自行搭建的便攜式拉曼光譜系統(tǒng)[25-27]采集蘋果表面的光譜信息，激發(fā)光波長為785 nm，積分時間 2 s，激光功率 350 mW，采集范圍在 200～2 650 cm-1。

純度99.9%的啶蟲脒原藥購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%的啶蟲脒乳油購于天津華宇農(nóng)藥有限公司，聚丙烯酸鈉（sodium polyacrylate，PAAS）、硝酸銀、丙酮、鹽酸羥胺、氫氧化鈉、氯化鈉購于上海源葉生物科技有限公司，純度 98%，超純水購于北京藍(lán)弋化工有限公司。

1.2 銀溶膠制備

納米銀膠體是基于 Leopold等[28]的方法，首先制備1.1×10-3mol/L硝酸銀溶液90 mL備用，然后將鹽酸羥胺與氫氧化鈉溶解于10 mL去離子水中，制備成濃度分別為1.5×10-2mol/L和3.0×10-2mol/L的混合溶液，將新鮮制備的混合溶液迅速倒入90 mL硝酸銀溶液中，并持續(xù)攪拌30 min得到灰綠色銀溶膠，最后將所得銀溶膠與等體積PAAS（0.5%）混合，得到穩(wěn)定的銀溶膠溶液，保存于4 ℃黑暗環(huán)境下。

1.3 增強(qiáng)基底影響因素

以氯化鈉作為增強(qiáng)基底的團(tuán)聚劑[29]，取氯化鈉固體分別配制0.2、0.5、1.0、2.0 mol/L氯化鈉溶液50 mL，以10 mg/kg的啶蟲脒溶液為底物，用于探究增強(qiáng)效果的變化。同時配制40 mmol/L的硝酸溶液用于調(diào)節(jié)銀溶膠的酸堿度（pH值），用以改進(jìn)銀溶膠的增強(qiáng)效果。

1.4 樣品制備

利用10%啶蟲脒乳油配制啶蟲脒溶液，溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.5%～10.0%，共24個濃度梯度。選用24個大小質(zhì)量幾乎一致的紅富士蘋果（購于北京美廉美超市），經(jīng)去離子水洗滌并置于通風(fēng)櫥靜置0.5 h晾干。據(jù)文獻(xiàn)顯示[30]，靜置晾干后，將全果浸泡于 24個濃度梯度（0.5%～10.0%）的啶蟲脒溶液5 min，然后靜置于陰涼處48 h后，果肉中農(nóng)藥含量最接近全果農(nóng)藥含量。該方法不僅能夠模擬農(nóng)藥從表面內(nèi)吸及滲透進(jìn)入果皮和果肉，而且從果梗處進(jìn)入較多，符合實際使用中內(nèi)吸農(nóng)藥從果樹枝干經(jīng)營養(yǎng)運(yùn)輸通道進(jìn)入蘋果果實的情況[31-32]。

1.5 光譜采集

將獲得的含穩(wěn)定劑 PAAS的銀膠體溶液以2 000 r/min離心20 min，并通過超聲重新分散在1 mL母液中。在采集光譜之前，先將丙酮（10μL）滴在蘋果表面上，以使農(nóng)藥分子與果皮基質(zhì)分離，然后加入5μL銀膠體，再迅速加入適量硝酸溶液和氯化鈉溶液，室溫下利用實驗室自行搭建的便攜式拉曼檢測系統(tǒng)采集蘋果的拉曼光譜曲線。每個蘋果在蘋果表面采集均勻分布的 15個點，其中蘋果果梗、花萼及最大圓周處各采集5個點，每個點采集 6次，通過對光譜進(jìn)行平均處理得到的平均光譜作為樣品原始光譜。

1.6 氣相色譜法檢測蘋果農(nóng)藥含量測試

將采集光譜后的蘋果迅速放入密封袋中，參照國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 5009.110—2003和GB/T 5009.146—2008，采用氣相色譜法對蘋果中啶蟲脒含量進(jìn)行檢測。

1.7 拉曼光譜分析

拉曼光譜信號采集的過程中，由于外界環(huán)境和系統(tǒng)自身的穩(wěn)定性等方面因素的影響，使采集的光譜除了樣品自身有用信息外，還包含了其他無關(guān)的信息和噪聲。因此，為了消除這些無關(guān)信息和噪聲，保證光譜和農(nóng)藥濃度之間具有良好的相關(guān)性，需要對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。本研究基于蟻群算法改進(jìn)的拉曼特征尋峰方法，將多次采集的梯度濃度范圍的農(nóng)藥拉曼光譜進(jìn)行統(tǒng)計分析，用于特征峰識別定性農(nóng)藥種類，便于去除無關(guān)的光譜信息。還有基于卡爾曼濾波器的卡爾曼平滑算法，不要求信號和噪聲都是平穩(wěn)的，通過前向遞進(jìn)和后向遞進(jìn)的方法得誤差最小即最優(yōu)估計的真實值，從而最大程度上去除光譜信號的噪聲，提高分析精度。非對稱重加權(quán)懲罰最小二乘法（asymmetrically reweighted Penalized Least Squares，arPLS）能自動擬合并去除光譜基線和校正拉曼特征峰值。擴(kuò)展乘性散射校正（Extended Multiplicative Signal Correction，EMSC）用于光譜散射校正結(jié)合偏最小二乘回歸算法（Partial Least Squares Regression，PLSR）建立定量預(yù)測模型，能提高模型精度。比較校正集的相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient，Rc）與預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)（prediction coefficient，Rp）、校正均方根誤差（Root Mean Square Errors of calibration，RMSEc）和預(yù)測均方根誤差（Root Mean Square Error of predictions，RMSEp）來評價模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀溶膠SERS基底的表征

用紫外分光光度計對銀溶膠的紫外吸收光譜進(jìn)行表征，如圖1所示，在416 nm處觀察到了明顯的銀納米粒子等離子體共振吸收峰，吸收峰為窄峰，說明制備的銀溶膠為單分散系，較多分散系溶膠，粒子均一性更好。

2.2 農(nóng)藥和蘋果譜帶歸屬

由于拉曼光譜的峰位反映物質(zhì)化學(xué)鍵的振動或轉(zhuǎn)動頻率，因此不同位置的拉曼峰可代表不同化學(xué)鍵，反映分子的結(jié)構(gòu)信息，從而通過拉曼光譜可以確定分子的結(jié)構(gòu)，同樣分子的化學(xué)鍵等結(jié)構(gòu)信息也表現(xiàn)在拉曼光譜上。通過在蘋果上滴加銀溶膠分別采集不含農(nóng)藥的洗凈蘋果和含國標(biāo)限濃度0.8 mg/kg啶蟲脒的蘋果的SERS光譜以及啶蟲脒原藥的拉曼光譜如圖2所示。從圖2的數(shù)據(jù)可見，無農(nóng)藥蘋果樣品的拉曼光譜曲線沒有明顯的拉曼峰。啶蟲脒農(nóng)藥拉曼峰主要在634 cm-1，842 cm-1，1 114 cm-1，1 294 cm-1和2 196 cm-1處出現(xiàn)，分別對應(yīng)C—Cl伸縮、環(huán)振動和環(huán)“呼吸”、環(huán)伸縮和C=N伸縮譜帶。含啶蟲脒農(nóng)藥的蘋果樣品的SERS光譜拉曼峰主要在627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-1處出現(xiàn)，分別是Cl伸縮、環(huán)“呼吸”和環(huán)伸縮譜帶[8]。因為不同譜帶的化學(xué)鍵類型和結(jié)構(gòu)不同，銀溶膠 SERS基底的增強(qiáng)作用也不同，627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-1處拉曼特征峰最能代表啶蟲脒農(nóng)藥SERS光譜信息。

2.3 pH值對銀膠體的影響

采用銀膠體對蘋果表面農(nóng)藥進(jìn)行增強(qiáng)時，由于其pH值不同，增強(qiáng)效果也不同，蘋果表面啶蟲脒農(nóng)藥本身呈現(xiàn)弱酸性，若采用堿性銀膠體，酸性農(nóng)藥在堿性環(huán)境下可能會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。因此有必要試驗不同pH值的銀膠體對增強(qiáng)效果的影響。試驗過程采用1 mol/L的NaCl作為團(tuán)聚劑，通過配制的40 mmol/L的硝酸溶液去改變銀膠體的pH值，并用pH計控制，得到pH值分別從2.5～7的不同酸堿度的增強(qiáng)基底，并用這些基底去測試相同的10 mg/kg的啶蟲脒溶液，結(jié)果如圖3所示，整體趨勢是增強(qiáng)基底的增強(qiáng)效果隨著pH值的減小而減弱。這是因為用鹽酸羥胺與NaOH制成的銀膠粒子表面有偶電層（Ag+為負(fù)吸附質(zhì)），H+被靜電力吸引聚集在表面等離子共振體上，搶占了啶蟲脒分子的活性熱點。隨著pH值下降，H+增多，銀溶膠的增強(qiáng)效果會大大下降。但是pH值為7時，相比于pH值為6.5，增強(qiáng)效果變低。這是因為啶蟲脒農(nóng)藥本身是呈弱酸性的，只有在這種條件下啶蟲脒分子能夠盡可能的吸附到銀溶膠粒子上，而pH值為7時啶蟲脒已經(jīng)消耗掉一些，所以反而增強(qiáng)效果沒有 pH值為6.5時的好。從圖3中可以看出，當(dāng)pH值為6.5時，檢測效果較好。

2.4 NaCl團(tuán)聚劑對銀膠體的影響

表面增強(qiáng)效應(yīng)因金屬納米粒子和不同待測分子的電荷屬性和結(jié)合程度之間的差異，導(dǎo)致吸附程度的不同給拉曼光譜進(jìn)行低濃度物質(zhì)的分析帶來挑戰(zhàn)。在不加入團(tuán)聚劑時，僅僅依靠 Ag+的電化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行增強(qiáng)，針對蘋果表面啶蟲脒檢測限較高，不能滿足檢測要求。因此向銀溶膠中引入電解質(zhì)作為團(tuán)聚劑可以改善表面增強(qiáng)的效果[33]。通過向銀溶膠中引入團(tuán)聚劑NaCl，加快結(jié)合速度來改善銀溶膠增強(qiáng)效果。使用NaCl作為團(tuán)聚劑是因為銀溶膠屬于惰性溶膠，對電解質(zhì)比較敏感，膠粒的穩(wěn)定性完全靠吸附保護(hù)劑和建立雙電子層來維持。當(dāng)體系中加入電解質(zhì)會破壞電荷平衡，從而導(dǎo)致粒子聚沉。適當(dāng)?shù)囊腚娊赓|(zhì)可以使粒子聚集，快速創(chuàng)造更多的活性熱點，提高增強(qiáng)效果。同時啶蟲脒表面的Cl原子易發(fā)生拉電子效應(yīng)，CN和CN發(fā)生共軛誘導(dǎo)效應(yīng)，故帶有一定的負(fù)電荷。而在酸性條件下溶膠粒子表面正電荷居多，使啶蟲脒分子更容易接近銀溶膠。但是過量的Cl-引入會使粒子聚集越來越大，反而使活性熱點減少，最后聚沉，正如圖4中數(shù)據(jù)可見，NaCl溶液濃度從0上升到1 mol/L時啶蟲脒的光譜也隨之增強(qiáng)，而NaCl溶液濃度為2 mol/L時卻會引發(fā)聚沉，增強(qiáng)效果大打折扣，因此當(dāng)NaCl溶液濃度為1 mol/L時，檢測效果最好。

在確定合適NaCl（1 mol/L）濃度后，向25μL銀溶膠中加入體積為5、10、15、20和25μL的1 mol/L NaCl溶液采集10 mg/kg啶蟲脒溶液SERS光譜來探究NaCl溶液與銀溶膠比例對啶蟲脒檢測的影響。如圖5中數(shù)據(jù)可見，當(dāng)1 mol/LNaCl溶液加入量超過5μL時，增強(qiáng)效果開始下降。所以選取1 mol/L NaCl溶液與銀溶膠按照 1∶5的比例混合能有效的提高啶蟲脒檢測效果。

2.5 改進(jìn)的銀溶膠的穩(wěn)定性研究

為了評估按照上述方法改進(jìn)后的銀溶膠對啶蟲脒的增強(qiáng)效果的穩(wěn)定性，采用改進(jìn)的銀溶膠與原始銀溶膠分別對10 mg/kg啶蟲脒溶液采集20次SERS光譜。結(jié)果如圖6所示，使用改進(jìn)后的銀溶膠對同樣濃度的啶蟲脒檢測時拉曼信號更好。對比了627，835和1 107 cm-13個特征峰強(qiáng)度在兩種銀溶膠增強(qiáng)效果如表1所示，使用改進(jìn)后的銀溶膠的特征峰離散程度更小，分布更為集中。而且通過提取并計算 3個特征峰強(qiáng)度值的變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)在使用改進(jìn)的銀溶膠后 3個特征峰強(qiáng)度值的變異系數(shù)均有明顯降低，特別是在1 107 cm-1處較為明顯。經(jīng)過綜合分析表明，使用了改進(jìn)的銀溶膠后，對于啶蟲脒的SERS光譜穩(wěn)定性有了明顯的提升，有利于進(jìn)一步進(jìn)行蘋果中啶蟲脒農(nóng)藥殘留的定量分析。

表1 啶蟲脒表面增強(qiáng)拉曼特征峰值強(qiáng)度及變異系數(shù)Table 1 Coefficient of variation of SERS characteristic peaks intensity of acetamiprid

2.6 蘋果中啶蟲脒殘留的定量分析

2.6.1 重復(fù)性試驗

取30個蘋果，用20 mg/kg的啶蟲脒溶液在相同條件下制備，調(diào)整銀膠體pH值為6.5并采用1 mol/L的NaCl溶液作為團(tuán)聚劑進(jìn)行試驗，采集蘋果表面SERS光譜后經(jīng)熒光背景扣除后，計算啶蟲脒SERS光譜在627，835和1 107 cm-1處的特征峰強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.14%、6.83%、6.99%，表明該測試方法的重復(fù)性良好，能夠用于定量分析。

2.6.2 確定最低檢出限

取24個蘋果，分別配制了0.012～10.830 mg/kg的24個濃度梯度用于制備蘋果樣本，采集其SERS光譜，經(jīng)基線扣除和尋峰算法處理，結(jié)果如圖7所示。

由于尋峰算法是基于特征峰數(shù)量最小為2以及3倍噪音原理，所以在此方法下啶蟲脒的最低檢出限可以達(dá)到 0.035 mg/kg，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)允許最大檢出限0.8 mg/kg[34]，較原始銀溶膠最低檢出限0.15 mg/kg也有降低[8]。

2.6.3 建立定量預(yù)測模型

選取24個蘋果在檢測范圍內(nèi)配制0.082～3.830 mg/kg不同濃度啶蟲脒農(nóng)藥，在采集完SERS光譜后，在濃度梯度范圍內(nèi)均勻選取18個蘋果做校正集，6個蘋果做驗證集。由于采集到的蘋果拉曼光譜包含熒光噪音信號，因此需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，在不改變光譜性質(zhì)的情況下消除噪音信號，本文比較了在PLSR算法下不同預(yù)處理方式的建模效果，發(fā)現(xiàn)卡爾曼平滑+擴(kuò)展乘性散射校正+基線扣除的組合預(yù)處理效果較優(yōu)，Rp達(dá)到了0.935，RMSEP為0.067 2 mg/kg，如表2所示?；谳^優(yōu)的預(yù)處理方法分別用PLSR和MLR建模，比對建模效果。同時也對啶蟲脒的拉曼特征峰建模效果進(jìn)行比對，結(jié)果如表3所示，PLSR（Partial Least Squares Regression）建模效果要優(yōu)于MLR（Multiple Linear Regression），并且考慮到至少需要2個特征峰來確定物質(zhì)的存在，對627 cm-1和835 cm-12個特征峰建模的效果要優(yōu)于對 627 cm-1，835 cm-1和1 107 cm-13個特征峰，相關(guān)系數(shù)Rp達(dá)到了0.974。

表2 啶蟲脒農(nóng)藥不同預(yù)處理方式下的預(yù)測結(jié)果Table 2 Prediction results of different pretreatment methods of acetamiprid

表3 啶蟲脒農(nóng)藥不同建模方式下的結(jié)果Table 3 Results of different modeling methods for acetamiprid

綜上，以卡爾曼平滑+擴(kuò)展乘性散射校正+基線扣除的組合做預(yù)處理，選擇627 cm-1，835 cm-1處的特征峰拉曼強(qiáng)度建立的偏最小二乘回歸預(yù)測模型效果較佳，校正集相關(guān)系數(shù)Rc為 0.986，校正集均方根誤差 RMSEc為0.0369 mg/kg，驗證集相關(guān)系數(shù)Rp為0.974，校正集均方根誤差RMSEp為0.044 1 mg/kg?？梢院芎玫貙崿F(xiàn)對蘋果中啶蟲脒殘留的準(zhǔn)確檢測，為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測提供了一條新的分析途徑。

3 結(jié) 論

利用 SERS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)蘋果中啶蟲脒殘留的準(zhǔn)確檢測。

1）本文通過控制銀溶膠pH值為6.5，調(diào)整農(nóng)藥在銀膠體粒子表面吸附狀態(tài)，使得檢測效果更好。

2）探索了團(tuán)聚劑與銀溶膠 1∶5的比例向銀溶膠中加入1 mol/L NaCl溶液，可以促進(jìn)啶蟲脒分子與銀溶膠吸附，提高拉曼信號的同時，降低了啶蟲脒在蘋果中的最低檢出限以及提高檢測精確度。

3）本文的研究方法在蘋果無需前處理是情況下，對蘋果中啶蟲脒最低檢出限可達(dá)0.035 mg/kg，低于國家規(guī)定的農(nóng)作物農(nóng)藥最大殘留限。

4）啶蟲脒殘留的量化分析通過利用卡爾曼平滑結(jié)合擴(kuò)展乘性散射校正和基線扣除法作為預(yù)處理方法，選取627，835 cm-1處的特征峰強(qiáng)度來建立偏最小二乘回歸模型。優(yōu)化模型的預(yù)測相關(guān)系數(shù)Rp為0.974，分析誤差達(dá)到RMSEp為0.044 1 mg/kg。由此可知，SERS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可以很好地實現(xiàn)蘋果中啶蟲脒殘留的準(zhǔn)確檢測。