不同添加劑改善甜高粱青貯質(zhì)量及其降解性能比較

任海偉，趙 藝，劉玉龍，馮銀萍，張丙云，李金平,3※，李志忠

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院/西部能源與環(huán)境研究中心，蘭州 730050；2.甘肅省生物質(zhì)能與太陽(yáng)能互補(bǔ)供能系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；3.西北低碳城鎮(zhèn)支撐技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，蘭州 730050）

0 引 言

甜高粱是一種重要的 C4高糖分飼糧作物和能源作物，具有抗旱、耐澇、耐鹽堿、生物量高等特點(diǎn)，能適應(yīng)多種氣候與環(huán)境條件，在中國(guó)甘肅、山東、黑龍江等地均有大面積種植，被廣泛用于動(dòng)物飼料、生物質(zhì)能（乙醇、沼氣等）和生物基材等領(lǐng)域[1-2]。由于甜高粱收獲具有明顯季節(jié)性和時(shí)效性，貯存不及時(shí)極易引起水分、糖分流失甚至腐敗變質(zhì)，嚴(yán)重影響其能源轉(zhuǎn)化利用效率。青貯作為一種經(jīng)典的濕法保存技術(shù)，不僅常用于作物秸稈等生物質(zhì)原料的貯存[3]，而且青貯過程還蘊(yùn)藏有生化預(yù)處理作用[4-5]。研究表明，青貯過程中加入乳酸菌等微生物菌劑、酶制劑、木質(zhì)纖維功能分解菌等添加劑能發(fā)揮一定的強(qiáng)化處理作用，提高生物質(zhì)的降解性能和能源產(chǎn)出潛力[6]。纖維素酶及產(chǎn)生阿魏酸酯酶的乳酸菌能促進(jìn)玉米秸稈青貯發(fā)酵和木質(zhì)纖維素降解，提高酶解糖化得率[7]。稻草青貯過程中添加木聚糖酶、植物乳桿菌能提高發(fā)酵質(zhì)量和纖維素轉(zhuǎn)化率[8]。另一方面，自然進(jìn)化的鬼斧神工和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)智慧提示我們，“鮮活”的反芻動(dòng)物瘤胃液、厭氧消化沼液等生物載體棲息有大量天然微生物菌群及其代謝酶系，是一類能有效克服木質(zhì)纖維抗降解屏障的天然特異“生物處理系統(tǒng)”[9]。瘤胃液預(yù)處理稻草能有效促進(jìn)其甲烷產(chǎn)量和有機(jī)質(zhì)降解程度[9]。沼液預(yù)處理玉米秸稈能使其木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)變松散，降低化學(xué)反應(yīng)活化能，加快纖維素分解[10-11]。更重要的是，瘤胃液、沼液這些生物載體還具備與濕法青貯過程進(jìn)行耦合協(xié)同的共同環(huán)境基礎(chǔ)（厭氧、低pH值等）、物質(zhì)基礎(chǔ)和代謝紐帶。若能將富含木質(zhì)纖維分解菌的沼液、瘤胃液用于甜高粱青貯過程，則有可能通過生物強(qiáng)化作用實(shí)現(xiàn)貯存和強(qiáng)化預(yù)處理的雙重目標(biāo)，以時(shí)間（貯存）爭(zhēng)取空間（降解糖化產(chǎn)出），提升生物質(zhì)降解潛力。

甜高粱莖稈表面覆蓋有硅氧蠟質(zhì)層，以及由木質(zhì)素、半纖維素和纖維素形成的致密性晶體結(jié)構(gòu)，使其不容易被分解。本文基于全株甜高粱的跨季貯存和能源化利用，從化學(xué)組分、發(fā)酵品質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)、酶解特性等方面，比較研究瘤胃液、沼液、纖維素酶和木聚糖酶 4種添加劑對(duì)甜高粱青貯品質(zhì)的動(dòng)態(tài)影響，并考察不同青貯周期時(shí)的生物降解潛力差異性，進(jìn)而評(píng)價(jià) 4種添加劑在青貯過程中的強(qiáng)化作用效果，篩選適宜的、有應(yīng)用價(jià)值的青貯添加劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

全株鮮綠甜高粱取自中科院近物所武威種植基地，收獲后迅速切碎至1～2 cm備用。瘤胃液取自于武威頂樂生態(tài)牧業(yè)有限公司第三養(yǎng)殖場(chǎng)，西門塔爾肉牛屠宰過程中收集瘤胃液，經(jīng)4層無菌紗布過濾后迅速轉(zhuǎn)移至厭氧袋，并存放至液氮罐中送回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆茫话l(fā)酵沼液來源于蘭州牧工商公司荷斯坦奶牛繁育中心的沼氣工程，沼液取回實(shí)驗(yàn)室后用高粱秸稈在（37±1）℃中溫環(huán)境下富集馴化一個(gè)月；纖維素酶和木聚糖酶（酶活力為50 000 U/g）購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。甜高粱原料的干物質(zhì)、有機(jī)組分和有機(jī)酸含量如表1 所示。新鮮沼液、瘤胃液的pH值、氨氮和有機(jī)酸含量、酶活性等指標(biāo)如表2所示。

表1 甜高粱的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indicators of sweet sorghum

表2 瘤胃液與沼液的理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indicators of rumen fluid and biogas slurry

1.2 儀器與設(shè)備

纖維分析儀（FB800），山東海能科學(xué)儀器有限公司；液相色譜儀（Agilent 1260），安捷倫公司；X-射線衍射儀（D/max-2400），日本理學(xué)公司；掃描電鏡（JSM-5600LV），日本電子光學(xué)公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nexus670），美國(guó)Nicolet公司。

1.3 青貯發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)與取樣

準(zhǔn)確稱取30份1.5 kg切碎的甜高粱進(jìn)行青貯發(fā)酵試驗(yàn)，設(shè)置纖維素酶（CT，3 g纖維素酶溶于70 mL蒸餾水）、木聚糖酶（XT，3 g木聚糖酶溶于70 mL蒸餾水）、瘤胃液（RT，添加量為70 mL/kg）、沼液（BT，添加量為70 mL/kg）4個(gè)處理組，以及1個(gè)空白對(duì)照組（CK，添加 70 mL蒸餾水），將添加劑均勻噴灑至樣品表面后迅速混勻并裝入塑料桶中密封。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3次平行，（18±2）℃恒溫環(huán)境中青貯45 d和90 d，定期分析青貯質(zhì)量和生物降解性。青貯樣品的取樣步驟以及發(fā)酵浸提液制備方法參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.4 青貯質(zhì)量分析

1.4.1 化學(xué)成分和發(fā)酵品質(zhì)

干物質(zhì)（Dry Matter，DM）含量測(cè)定用105 ℃烘干恒重法，總氮（Total Nitrogen，TN）含量采用凱氏定氮法，可溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrate，WSC）分析用硫酸-蒽酮法[13]，淀粉含量測(cè)定采用酸水解法，中性洗滌纖維（Neutral Detergent Fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（Acid Detergent Fiber，ADF）和酸性洗滌木質(zhì)素（Acid Detergent Lignin，ADL）含量通過纖維分析儀測(cè)定。纖維素（Cellulose，CL）、半纖維素（Hemicellulose，HC）和綜纖維素（Holocellulose，HoC）組分通過公式計(jì)算[14]。pH值采用 UB-7酸度計(jì)分析，氨氮（Ammonia Nitrogen，AN）采用苯酚-次氯酸鈉比色法分析，有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）等小分子發(fā)酵產(chǎn)物分析采用HPLC檢測(cè)[7,15]。纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶活性的測(cè)試均采用南京建成生物工程研究所采購(gòu)的試劑盒，具體操作參照說明步驟進(jìn)行。

1.4.2 結(jié)構(gòu)特性表征

利用掃描電鏡觀察樣品的微觀形貌（噴金儀噴鍍40 s，鍍膜厚度4 nm左右，加速電壓20 kV）。利用傅里葉變換紅外光譜儀分析樣品官能團(tuán)結(jié)構(gòu)（掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1）。采用Rigaku X-射線衍射儀分析結(jié)晶性能（Cu-Kα 為靶材，掃描速率為 1°/min，掃描范圍5°～60°，加速電壓 40 kV，電流 100 mA），并計(jì)算相對(duì)結(jié)晶指數(shù)[14]。

式中 CrI為相對(duì)結(jié)晶指數(shù)的百分率（%）；I002為結(jié)晶區(qū)的衍射強(qiáng)度（2θ=22°）；Iam為無定形區(qū)衍射強(qiáng)度（2θ=18°）。

1.5 生物降解性能評(píng)價(jià)

生物降解性能主要從理論生物降解潛力（Theoretical Biodegradation Potential，TBP）和實(shí)際酶解糖化得率兩方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。TBP為綜纖維素和木質(zhì)素組分含量之比值（干物質(zhì)基礎(chǔ)）。酶解糖化能力評(píng)價(jià)方法：準(zhǔn)確稱取0.5 g甜高粱原料或青貯樣品（過100目篩），以1∶20料液比加入pH值4.8、濃度為0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液，再依次添加纖維素酶（加酶量1 000 U/g）、半纖維素酶（加酶量500 U/g）、β-葡聚糖苷酶（加酶量1 U/g）進(jìn)行酶解試驗(yàn)。恒溫氣浴振蕩酶解72 h（150 r/min，(50±0.5 )℃)，間隔12 h測(cè)定酶解液中的還原糖濃度，并計(jì)算酶解得率（Enzymatic Hydrolysis Yield，EHY，%）[16]。

式中c為還原糖濃度，g/mL；v為上清液體積，mL；m為底物質(zhì)量，g。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2007軟件處理基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Origin Pro 9.1軟件繪圖，SPSS 20.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析，單因子 ANOVO模型處理及Duncan方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加劑瘤胃液和沼液的微生物菌群分析

利用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)分析瘤胃液、沼液中的細(xì)菌菌群多樣性（表3）。

表3 瘤胃液和沼液的門、屬水平上細(xì)菌多樣性Table 3 Bacterial diversity of rumen fluid and biogas slurry at phylum and genus level

由表3可知，瘤胃液的門水平細(xì)菌主要有厚壁菌（Firmicutes，61.00%）和擬桿菌（Bacteroidetes，31.10%），沼液中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌除厚壁菌（Firmicutes，32.58%）和擬桿菌（Bacteroidetes，35.08%）外，還含有一定量互養(yǎng)菌（Synergistetes，17.12%）。研究表明，大多數(shù)厚壁菌和擬桿菌的細(xì)菌菌群均有木質(zhì)纖維水解和蛋白質(zhì)降解能力，且二者存在一種相互促進(jìn)的共生關(guān)系[17]?；ヰB(yǎng)菌還能發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸和乙醇，也是一類重要的木質(zhì)纖維分解菌[18-19]。從屬水平看，瘤胃液的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要為克里斯滕森氏菌（Christensenellaceae，20.09%）和瘤胃球菌（22.01%）。這些細(xì)菌區(qū)系均能有效降解木質(zhì)纖維素，而且前者還有發(fā)酵糖類產(chǎn)生乙酸、丁酸等有機(jī)酸的能力[20-21]。沼液的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要有理研菌（Rikenellaceae，26.89%）和少量梭菌（Clostridium，5.44%）、嗜蛋白菌（Proteinip-hilum，4.00%）和假單胞菌（Pseudomonas，2.02%）。其中，假單胞菌具有攻擊芳香族聚合物木質(zhì)素的能力，盡管其相對(duì)豐度相對(duì)較低，但它對(duì)木質(zhì)素降解仍有積極作用[10]。

2.2 添加劑對(duì)青貯過程中化學(xué)組分的影響

2.2.1 干物質(zhì)含量和干物質(zhì)損失率

干物質(zhì)含量是評(píng)價(jià)甜高粱青貯品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。由表1和圖1可知，與原料相比，青貯45 d時(shí)5個(gè)試驗(yàn)組的干物質(zhì)含量均顯著下降（P＜0.05），尤其RT組處于最低值；青貯45～90 d期間，CT、XT和BT處理組的干物質(zhì)含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低（P＜0.05），而CK和RT組在此期間未發(fā)生明顯變化（P＞0.05）。這與Naeini等[16]報(bào)道的青貯甜高粱干物質(zhì)含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)結(jié)果基本吻合。分析原因，一方面，加入的纖維素酶、木聚糖酶等生物酶和沼液（富含木質(zhì)纖維分解菌）在青貯發(fā)酵期間持續(xù)發(fā)生作用，將部分有機(jī)物質(zhì)分解為諸如小分子有機(jī)酸、乙醇和含氮化合物等揮發(fā)性物質(zhì)，使甜高粱中的干物質(zhì)含量顯著下降。另一方面，瘤胃液中含有大量諸如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等木質(zhì)纖維降解菌以及可以穿透植物細(xì)胞壁的真菌，多種微生物菌系協(xié)同作用使一部分纖維素和半纖維素快速分解，并轉(zhuǎn)化為乙酸為主的揮發(fā)性有機(jī)酸[9]。但隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，由于青貯體系pH值下降、乳酸菌等優(yōu)勢(shì)菌群占主導(dǎo)、瘤胃液中噬菌體等微生物病毒發(fā)揮抑制作用等諸多因素使得木質(zhì)纖維分解菌被抑制，從而減少干物質(zhì)分解，故其含量變化不顯著（P＞0.05）。

再者，BT組在90 d時(shí)的干物質(zhì)含量顯著低于CK組（P＜0.05），但與其他處理組差異不顯著（P＞0.05），這不僅是因?yàn)檎右褐械奈⑸锞杭捌涿赶祵⒌矸?、蛋白質(zhì)和木質(zhì)纖維素等組分降解轉(zhuǎn)化；而且沼液中豐富的氨氮可作為天然氨源，使木質(zhì)素內(nèi)部以及木質(zhì)素與多糖之間的化學(xué)鍵斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致木質(zhì)素膨脹并與纖維素分離，提高纖維素與半纖維素的可降解性，從而使干物質(zhì)損失率增加（圖1b）[10,22]。

2.2.2 可溶性碳水化合物含量

可溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrates，WSC）是青貯發(fā)酵過程中乳酸菌群繁殖代謝的重要底物，含量多寡及其變化規(guī)律一定程度上也能反映不同種類添加劑在青貯過程中的強(qiáng)化作用效果。由圖2和表1可知，青貯45 d時(shí)5個(gè)試驗(yàn)組的WSC含量均顯著低于原料（P＜0.05），且CT和XT組的WSC含量顯著低于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），BT組的WSC含量最高，這可能是因?yàn)榛钚暂^強(qiáng)的沼液中富含木質(zhì)纖維素分解菌及纖維素酶等復(fù)合酶系，相較于纖維素酶或木聚糖酶等單一酶制劑而言，更能充分有效地分解甜高粱中纖維素、半纖維素、淀粉等大分子碳水化合物，使WSC生成速率高于消耗速率，形成可溶性糖的累積效應(yīng)[9]。此外，沼液還能促進(jìn)秸稈木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的膨脹崩解，使其通透性增加，更容易被微生物及其酶系降解[22]。另一方面，青貯90 d時(shí)CT組的WSC含量較45 d時(shí)明顯增加（P＜0.05），這可能是纖維素酶能降解秸稈中不與木質(zhì)素存在化學(xué)鍵聯(lián)結(jié)的細(xì)胞壁成分所致；而且青貯環(huán)境中乳酸菌占優(yōu)勢(shì)、腐敗微生物菌群被抑制等因素也會(huì)使CT組中WSC消耗速率降低，導(dǎo)致WSC積累增加。

總之，整個(gè)青貯發(fā)酵期間，RT和 BT組中的 WSC含量始終高于其他試驗(yàn)組，尤其BT組在45和90 d時(shí)均為最高值，說明甜高粱青貯體系中添加沼液的生物強(qiáng)化作用效果最為明顯。

2.2.3 木質(zhì)纖維組分和淀粉含量

由表4可知，添加劑、時(shí)間及其交互作用均對(duì)木質(zhì)纖維組分有極顯著影響（P＜0.001）。中性洗滌纖維（Neutral Detergent Fiber，NDF）包括了植物細(xì)胞壁的大部分成分，主要有不溶性纖維素、半纖維素等非淀粉多糖和木質(zhì)素。與原料相比，45 d時(shí)各試驗(yàn)組（除BT組）的NDF含量均未發(fā)生顯著變化，但在 90 d時(shí)顯著低于原料（P＜0.05），說明無論是否加入添加劑或何種種類，長(zhǎng)時(shí)間青貯發(fā)酵均有助于NDF組分的降解。尤其添加沼液的BT組中NDF組分含量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著下降趨勢(shì)，且在整個(gè)青貯期間均顯著低于其他處理組（P＜0.05）。半纖維素（Hemicellulos，HC）是組成植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性多糖，由不同類型單糖組成，常與纖維素和木質(zhì)素緊密交聯(lián)形成木質(zhì)纖維素，該組分的含量變化也存在與纖維素相類似的趨勢(shì)。因?yàn)檎右褐斜旧泶嬖谟写罅扛乘岷涂山到饽举|(zhì)纖維素的微生物菌群，能使難降解的高聚體木質(zhì)素以及被包裹的纖維素和半纖維素發(fā)生分解[23]，這些組分的降解都會(huì)使NDF含量隨之下降。

酸性洗滌木質(zhì)素（Acid Detergent Lignin，ADL）是影響纖維素和半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解的主要屏障，較高的 ADL 含量會(huì)導(dǎo)致生物降解性能下降，進(jìn)而影響酶解糖化效率。與原料相比，5個(gè)試驗(yàn)組在青貯期間的 ADL含量均明顯下降（P＜0.05）。尤其，RT組和BT組中的 ADL含量在 90d時(shí)分別降至 78.11 和79.01 g/kg，顯著低于其他處理組（P＜0.05），這得益于瘤胃液和沼液天然具備的木質(zhì)纖維分解能力，二者富含能降解植物細(xì)胞壁的微生物菌群及其酶系[23]。這與 Guo等[10]報(bào)道的玉米秸稈經(jīng)沼液預(yù)處理后木質(zhì)纖維素明顯下降的結(jié)果一致；Candia-García等[24]也發(fā)現(xiàn)瘤胃液能明顯降低稻草中的木質(zhì)纖維組分。可見，青貯過程中加入沼液、瘤胃液能發(fā)揮明顯的生物強(qiáng)化預(yù)處理作用，有效降低抗降解屏障組分ADL含量，促進(jìn)半纖維素降解，最大限度地保存纖維素組分[11]。這與纖維組分隨青貯時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高的變化趨勢(shì)相吻合（表4）。此外，上述木質(zhì)纖維組分的聯(lián)動(dòng)變化也間接影響能量組分綜纖維素的含量多寡。青貯90 d期間，BT組中的綜纖維素含量最低，RT組中的綜纖維素含量最高，因?yàn)榱鑫敢褐械睦w維分解菌對(duì)pH值敏感，在酸性青貯環(huán)境中活性較弱，降解作用趨于溫和；而沼液中的纖維分解菌對(duì)pH值變化適應(yīng)性較好，使綜纖維素組分的含量處于最低值。

表4 青貯過程中木質(zhì)纖維組分的變化Table 4 Changes of lignocellulosic components during ensiling (g·kg-1)

結(jié)合理論生物降解潛力（TBP）分析，青貯45 d時(shí)，4個(gè)添加劑組的TBP均明顯增加（P＜0.05），而CK組則無明顯變化（P＞0.05）。青貯90 d時(shí)，CT和XT組的TBP不增反降，而RT和BT則保持不變。說明，添加劑的加入均有助于提升青貯甜高粱的理論降解潛力，起到明顯的強(qiáng)化處理作用，而且添加瘤胃液、沼液的作用效果相對(duì)較好，但實(shí)際改善效果需通過酶解糖化試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

淀粉是全株甜高粱中重要的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物。由圖3和表1可知，青貯45 d時(shí)，CK和CT組的淀粉含量與原料相比差異不顯著（P＞0.05），而XT、RT和BT組的淀粉含量在青貯45 d時(shí)顯著高于原料。然后，5個(gè)試驗(yàn)組的淀粉含量均隨青貯時(shí)間延長(zhǎng)而呈顯著下降（P＜0.05），90 d時(shí)的5個(gè)試驗(yàn)組的淀粉含量均明顯低于原料（P＜0.05），但組間差異不明顯，說明4種添加劑對(duì)淀粉含量的影響無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 添加劑對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.3.1 pH值

青貯pH值的下降速率和程度是反映發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)[25]。由圖4可知，發(fā)酵45 d時(shí)，由于青貯體系內(nèi)乳酸菌等有益菌及其他微生物的厭氧生化反應(yīng)，將可溶性糖轉(zhuǎn)化為乳酸（pKa=3.86）和乙酸（pKa=4.75）等有機(jī)酸[26]，使5個(gè)試驗(yàn)組的pH值均迅速下降至3.67～3.90范圍，明顯低于原料（pH 值5.62），均達(dá)到優(yōu)良青貯標(biāo)準(zhǔn)（3.8～4.2）。低 pH值能有效抑制蛋白酶活性，減少蛋白質(zhì)降解，抑制對(duì)青貯有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而保障青貯品質(zhì)。當(dāng)青貯周期延長(zhǎng)至90 d時(shí)，CK、CT和XT組的pH值繼續(xù)顯著下降（P＜0.05），維持在 3.52～4.29；RT和 BT組則呈顯著增加趨勢(shì)（P＜0.05），pH值分別為 4.29和 3.93。分析原因，纖維素酶、木聚糖酶對(duì)結(jié)構(gòu)性碳水化合物的直接催化降解作用進(jìn)一步促進(jìn)了乳酸等有機(jī)酸的發(fā)酵累積，導(dǎo)致青貯pH顯著下降[17,27]。另一方面，瘤胃液、沼液因其特有的微生態(tài)菌群結(jié)構(gòu)，容易生成較高含量的乙酸[9]；而且青貯發(fā)酵生成的乳酸又會(huì)被反過來被沼液、瘤胃液中微生物菌群作為代謝底物而消耗減少[28]，導(dǎo)致乳酸和乙酸含量的此消彼長(zhǎng)，這些因素的疊加造成了RT和BT組pH值隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高，這與表5中的有機(jī)酸變化趨勢(shì)相吻合。

2.3.2 氨氮含量

青貯蛋白質(zhì)的水解通常是由植物蛋白酶將其水解為肽和游離氨基酸，然后通過微生物菌群活動(dòng)進(jìn)一步降解為酰胺、胺和氮等因素引起的。

由圖5可知，青貯90 d期間，各試驗(yàn)組（除CT組不變外）的氨氮含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降（P＜0.05），這可能是因?yàn)檩^低的酸性 pH青貯環(huán)境有效抑制了芽孢桿菌、沙門氏菌等腐敗菌生長(zhǎng)以及甜高粱植株中的蛋白酶活性，從而減少蛋白質(zhì)分解[29]；添加纖維素酶對(duì)限制氨氮的產(chǎn)生并無顯著影響，這與Guo 等[30]研究結(jié)果一致。另一方面，青貯45 d時(shí)RT和BT組中氨氮含量顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），但仍低于優(yōu)質(zhì)青貯的氨氮限值（10%）。瘤胃液、沼液中自身本底含有一定量的氨氮，而且這兩類添加劑也富含蛋白質(zhì)降解菌，極易引發(fā)蛋白質(zhì)分解和氨氮增加[9]。當(dāng)青貯周期延至90 d時(shí)，RT和BT組中的氨氮含量又反而處于較低水平，這與青貯體系中較高濃度乙酸等抗菌物質(zhì)有效抑制蛋白質(zhì)分解菌群存在一定聯(lián)系[31]。

2.3.3 有機(jī)酸及乙醇含量

小分子有機(jī)酸和醇類物質(zhì)是青貯發(fā)酵過程中微生物菌群的主要代謝產(chǎn)物。由表5可知，隨著青貯時(shí)間的延長(zhǎng)，CK、CT和XT組中的乳酸含量顯著增加（P＜0.05），這是由于外源纖維素酶、木聚糖酶的加入直接促進(jìn)了纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物的催化分解，進(jìn)而通過優(yōu)勢(shì)乳酸菌群發(fā)酵產(chǎn)生并積累乳酸所致[27]。這與Zhao等[17]、陳鑫珠等[32]在柳枝稷、甘蔗梢青貯中的研究結(jié)果吻合。相反，RT和BT組中的乳酸含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降（P＜0.05），這主要與瘤胃液微生態(tài)系統(tǒng)中的乳酸代謝菌能將其轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸等物質(zhì)有關(guān)。此外，優(yōu)勢(shì)乳酸菌群從同型發(fā)酵類型向異型發(fā)酵的轉(zhuǎn)變也可能是原因之一[33]。另一方面，5個(gè)試驗(yàn)組的乙酸、丙酸含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高，且整個(gè)青貯期間 CT、XT和BT組中二者的含量均顯著低于CK和RT組（P＜0.05），而在RT組中含量則相對(duì)較高。這可能是因?yàn)镽T組中加入的瘤胃液存在大量產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌以及少量梭桿菌，這些微生物在厭氧條件下能產(chǎn)生較多的乙酸和丙酸[9]。Zhang等[34]也發(fā)現(xiàn)稻草厭氧發(fā)酵過程中添加瘤胃液，乙酸含量明顯提高。另外，青貯90 d時(shí)RT和BT組中檢測(cè)出少量丁酸，這可能是由于瘤胃液、沼液中的氨氮物質(zhì)會(huì)促進(jìn)梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)，從而產(chǎn)生具有損耗青貯品質(zhì)的丁酸所致[9,11,17]。乙醇也是甜高粱青貯過程的重要產(chǎn)物，和乙酸類似均能起到一定抑菌作用，抑制腐敗菌生長(zhǎng)，有助優(yōu)勢(shì)乳酸菌占據(jù)主導(dǎo)[23]。整個(gè)青貯期間，4個(gè)添加劑組的pH值均低于4.3，乳酸/總有機(jī)酸（乳/總）值始終高于0.58，乳酸/乙酸（乳/乙）值始終大于2.0，均達(dá)到優(yōu)良青貯發(fā)酵范疇[35]（除個(gè)別組），乳酸菌群發(fā)酵占主導(dǎo)，有效抑制了酵母菌繁殖代謝，從而顯著減少了乙醇含量（P＜0.05）。其中，CT和XT組的乳/總和乳/乙比值均顯著高于CK組，而RT和BT組的這兩個(gè)比值在45 d時(shí)顯著高于CK組，90 d時(shí)卻顯著低于CK組，這可能與瘤胃液、沼液中含有復(fù)雜多樣的微生物菌群有關(guān)，這些微生物群落的引入打破了原本相對(duì)簡(jiǎn)單的青貯乳酸發(fā)酵型態(tài)，將乳酸作為代謝底物利用轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸等小分子揮發(fā)酸[36]。

表5 青貯過程中有機(jī)酸與乙醇含量的變化Table 5 Changes of organic acid and ethanol contents during ensiling

2.4 甜高粱青貯前后的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 微觀形貌分析

由圖6可知，未青貯的甜高粱莖稈結(jié)構(gòu)較為致密，表面光滑平整，角質(zhì)層形成的包埋結(jié)構(gòu)無孔隙裂痕。青貯45 d時(shí)，所有試驗(yàn)組的甜高粱表面莖稈結(jié)構(gòu)均遭受破壞。其中，CT和XT組的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生微弱瓦解，RT和BT組則出現(xiàn)大量微孔洞、裂痕甚至斷裂分層現(xiàn)象，形成許多凹凸不平的溝槽，并呈現(xiàn)條紋鋸齒狀，說明青貯過程中添加瘤胃液、沼液能更有效地破壞甜高粱木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)。因?yàn)榱鑫敢汉驼右鹤陨砀缓瑥?fù)雜多樣的古菌、真菌及原蟲等微生物菌群，青貯發(fā)酵期間能穿透莖稈表面的蠟質(zhì)層和木質(zhì)化細(xì)胞壁，破壞莖稈內(nèi)部半纖維素和木質(zhì)素之間的酯鍵并形成裂痕[9]。

隨著青貯周期的延長(zhǎng)，90 d時(shí)五個(gè)試驗(yàn)組的孔洞、裂縫愈發(fā)明顯，尤其添加沼液的BT組出現(xiàn)大面積崩解塌陷，這是因?yàn)樘鸶吡辉谇噘A過程中除受到微生物菌群的持續(xù)作用外，長(zhǎng)時(shí)間的沼液浸潤(rùn)也能使木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)膨脹崩解，這與Guo等[10]結(jié)果相吻合。

2.4.2 官能團(tuán)分析

由圖7紅外光譜分析可知。

6個(gè)甜高粱樣品的紅外光譜圖總體表現(xiàn)出相似特征，明顯吸收峰值主要發(fā)生在3 413、2 926、1 733、1 604和1 050 cm-1。其中，3 413 cm-1處的寬峰代表纖維素羥基的伸縮振動(dòng)[37]，相較于未青貯的原料（SS組）而言，5個(gè)青貯樣品在3 413 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度均有所減弱；青貯45 d時(shí)BT組的吸收峰強(qiáng)度明顯低于其他處理組。說明纖維素組分在青貯期間均有不同程度地降解，其中青貯過程中添加沼液進(jìn)行強(qiáng)化處理可在較短時(shí)間內(nèi)有效降解或破壞甜高粱莖稈的結(jié)晶纖維素結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生分解作用。2 926 cm-1處的特征吸收峰表征木質(zhì)素中甲基、亞甲基（C-H）的伸縮振動(dòng)[37]，青貯90 d時(shí)4個(gè)處理組在此處的吸收峰均明顯低于45 d，說明青貯周期的延長(zhǎng)對(duì)木質(zhì)素脫除具有積極效果，且與青貯周期呈正相關(guān)。1 733和1 050 cm-1分別代表半纖維素-木質(zhì)素復(fù)合物的特征吸收峰以及半纖維素中C-O鍵的伸縮振動(dòng)[38-39]。青貯90 d時(shí)，RT、BT和XT組在這兩處的吸收峰與45 d相比明顯減弱，說明青貯周期延長(zhǎng)后瘤胃液、沼液對(duì)木質(zhì)素以及半纖維素的解聚效果明顯增強(qiáng)，青貯過程中添加木聚糖酶對(duì)半纖維素組分分解、木質(zhì)素組分釋放解聚有積極效果。1 604 cm-1處的伸縮振動(dòng)來源于吸附水分子氫鍵的彎曲振動(dòng)[22]。青貯后所有試驗(yàn)組在該處吸收峰強(qiáng)度均有不同程度地升高，且隨青貯時(shí)間延長(zhǎng)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說明青貯能促進(jìn)纖維素?zé)o定形組分的降解。

2.4.3 X-衍射分析

如圖8所示，與原料相比，五個(gè)青貯組的甜高粱樣品在 2θ=22°左右均出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，在 2θ=9°和 2θ=17°左右出現(xiàn)弱峰，說明加入不同添加劑的強(qiáng)化作用效果和厭氧生化反應(yīng)能使甜高粱莖稈中纖維素組分發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)重定向。結(jié)合相對(duì)結(jié)晶指數(shù)（CrI）可知，四個(gè)添加劑處理組的 CrI指數(shù)與 CK組和原料相比均有明顯下降，其中BT組降幅最大，說明外源添加劑的加入均能有效破壞纖維素和半纖維素與木質(zhì)素緊密結(jié)合的酯鍵與氫鍵；添加劑沼液中存在的高濃度氨氮更能進(jìn)一步促進(jìn)纖維素與木質(zhì)素的剝離[40]。另一方面，90 d時(shí)XT、RT和BT組中的纖維結(jié)晶指數(shù)較45 d有所提高（表6），這可能是因?yàn)榍噘A時(shí)間的延長(zhǎng)使非纖維素多糖或無定形區(qū)被溶解，導(dǎo)致纖維素結(jié)晶度增加[8]。此外，整個(gè)青貯期間BT組的CrI指數(shù)始終處于最低值，除了沼液中豐富的微生物菌群及其木質(zhì)纖維分解酶系所帶來的生物強(qiáng)化預(yù)處理作用外，沼液中豐富的氨氮組分對(duì)木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的分解也可能是該處理組CrI[10]

表6 甜高粱青貯前后的相對(duì)結(jié)晶指數(shù)變化Table 6 Changes of crystallization index of sweet sorghum before and after ensiling

2.5 甜高粱青貯前后的酶解糖化效果評(píng)價(jià)

酶解糖化效果是評(píng)價(jià)木質(zhì)纖維生物質(zhì)降解能力優(yōu)劣的重要指標(biāo)[39]。如圖9所示，無論甜高粱青貯與否，6個(gè)樣品底物在酶解初期（＜12 h）的酶解得率均呈現(xiàn)快速增加、直線上升趨勢(shì)，12h后酶解得率增速放緩。這是因?yàn)樵撾A段甜高粱中的纖維素和半纖維素組分優(yōu)先被生物酶作用釋放出較多的可發(fā)酵糖。隨著酶解進(jìn)程的推進(jìn)，木質(zhì)纖維底物的降解難度逐漸增加，而且還存在還原糖產(chǎn)物的反饋抑制作用，從而使酶解得率增速放緩[41]。另一方面，青貯甜高粱的酶解得率均顯著高于原料，說明青貯發(fā)酵能通過改善甜高粱木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)、優(yōu)化化學(xué)組分構(gòu)成、打破碳水化合物-木質(zhì)素之間聯(lián)系等形式促進(jìn)木質(zhì)纖維組分被酶解，進(jìn)而改善其酶解糖化性能。此外，不同種類添加劑的強(qiáng)化作用效果也不盡相同，由于瘤胃液和沼液中含有大量木質(zhì)纖維分解菌及水解酶類，使BT和RT組的酶解得率明顯高于CT和XT組。尤其青貯90 d時(shí)的BT組酶解糖化得率最高達(dá)84.69%，長(zhǎng)時(shí)間的酸性青貯環(huán)境、沼液中木質(zhì)纖維分解菌等微生物菌群、較高濃度的氨氮等因素都可能是有效提升酶解效能的重要原因，這些因素相互疊加起到明顯的生物強(qiáng)化處理作用[10,22]。

3 結(jié) 論

1）纖維素酶、木聚糖酶、瘤胃液和沼液4種添加劑均能使青貯體系的pH值顯著下降至4.3以下，除添加瘤胃液青貯90 d外，其他處理組的乳酸占總有機(jī)酸比例均高于0.58，乳酸與乙酸比值均高于2.0，說明四種添加劑均能有效促進(jìn)乳酸發(fā)酵，改善發(fā)酵質(zhì)量和青貯品質(zhì)。通過強(qiáng)化青貯作用，還能有效促進(jìn)木質(zhì)纖維組分分解及其優(yōu)化重組，進(jìn)而提高酶解得率和生物降解性能，其中甜高粱添加沼液青貯90 d時(shí)的酶解糖化得率最高，達(dá)到了84.69%。

2）青貯甜高粱的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了有利于生物降解性能提升的積極變化，尤其沼液、瘤胃液富含木質(zhì)纖維分解菌群，能在青貯發(fā)酵的同時(shí)有效瓦解甜高粱莖稈的木質(zhì)纖維抗降解屏障結(jié)構(gòu)，莖稈微觀表面出現(xiàn)明顯孔洞和裂縫，使纖維素相對(duì)結(jié)晶度指數(shù)明顯降低。尤其是沼液處理組的相對(duì)結(jié)晶指數(shù)在整個(gè)青貯期間均處于最低值，分別為 23.03和26.17。因此，在研究使用的4種添加劑中，添加沼液對(duì)甜高粱青貯過程的生物強(qiáng)化作用效果最佳。

3）綜合考慮4種添加劑的資源量、易得性、成本以及對(duì)甜高粱青貯質(zhì)量和生物降解性能的改善效果等因素，建議選擇來源廣泛、廉價(jià)易得、資源豐富的沼液作為甜高粱青貯過程的添加劑。這對(duì)于以甜高粱為原料的沼氣工程運(yùn)行具有重要意義，不僅能實(shí)現(xiàn)原料的可持續(xù)供給，提高生物降解性，還有助于消納轉(zhuǎn)化沼氣工程排放的一部分沼液，減少沼液排放量。