滇丹參質(zhì)量標準研究

★ 康興東 周朝忠 張金良 毛金娣 胡吉忠（.江西普正制藥股份有限公司 江西吉安 34300；2.江西省中藥消炎藥工程技術(shù)研究中心 江西 吉安 34300）

滇丹參為唇形科植物云南鼠尾草Salvia yunnanensisC.H.Wright的干燥根，又名丹參、小丹參、紫丹參等，具有活血祛瘀，涼血止血，養(yǎng)心安神，解毒消腫的功效。其可用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)，經(jīng)閉，惡露腹痛，癥瘕，胸痹絞痛，關(guān)節(jié)痛，疝痛，崩漏，吐血，衄血，咳血，血虛肢麻，失眠，健忘，驚悸，怔忡，乳癰，瘡腫，跌打瘀腫等疾病的治療，主產(chǎn)于云南、四川、貴州等地［1］。滇丹參的化學成分以萜類化合物和酚酸類化合物為主，還包括甾體、黃酮類等成分［2-5］。

滇丹參作為地方習用藥材，目前尚無國家藥材標準，僅《云南省中藥材標準》等地方中藥材標準有收載，但較為粗疏。本實驗采集10批不同產(chǎn)地滇丹參，考察其性狀、顯微特征、TLC薄層色譜特征、水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物等方面，并測定丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量，為該藥材質(zhì)量標準建立和規(guī)范使用提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備 美國Waters1525-2489型高效液相色譜儀；AUW2200十萬分之一電子分析天平（SHIMADZU 島津）；AB104-N萬分之一天平（梅特勒-托利多）；JK-300型超聲波清洗儀（合肥金尼克機械制造有限公司）；SK160 Digital生物顯微鏡（麥克迪奧光學儀器有限公司）；SX2-4-10 馬弗爐（上海實驗儀器廠）。

1.2 試劑與試藥 丹酚酸B對照品（111562-201110）、丹參酮ⅡA（110766-200619）、丹參對照藥材（120923-201414）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，西隴科學股份有限公司）、甲醇（分析純，天津市恒興化學試劑有限公司）、甲酸（分析純，天津市恒興化學試劑有限公司）、水均來自自制超純水。硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠）。

滇丹參藥材共10批，產(chǎn)自云南省各地，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 滇丹參為圓錐形，具分枝，長5～15 cm，直徑0.4～1.0 cm；蘆頭具密集的葉痕而成節(jié)，常扭曲。根表面有細根痕及縱皺紋，支根略呈紡錘形。表面紫褐色，質(zhì)堅脆，易折斷；斷面不平整，外層有時暗棕色，內(nèi)圈呈紫紅色、淺棕黃色。氣微，味苦澀、微甘。見圖1。

圖1 滇丹參藥材性狀

2.2 顯微鑒別

2.2.1 根橫切面特征木栓層為2～4列木栓細胞，皮層較寬，外側(cè)石細胞單個散在或2～5個成群，石細胞方形、長方形或長橢圓形，直徑17～48 μm，長至130 μm，壁厚1.5～3 μm，向內(nèi)側(cè)漸變??；內(nèi)側(cè)纖維極多，單個散在或2～20余個成群，纖維方形或多角形，直徑8～20 μm，壁厚3～15 μm，可見孔溝及層紋。韌皮部較窄，外側(cè)有少數(shù)纖維。形成層成環(huán)。木質(zhì)部導管束4～10束，向外漸寬。中央多為薄壁細胞。見圖2。

圖2 滇丹參根橫切面顯微圖

2.2.2 粉末特征石細胞多見，單個散在或數(shù)個成群，類梭形、長方形、類三角形或不規(guī)則多角形，邊緣具突起或稍膨大，直徑12～55 μm，長至230 μm，壁厚5～20 μm，孔溝明顯，紋孔稀疏，層紋少數(shù)可見。韌皮纖維長棒狀或長梭形，末端鈍圓、平整或鈍尖，長80～320 μm，直徑20～38 μm，壁厚8～19 μm，孔溝稍密，紋孔少數(shù)可見。網(wǎng)紋及螺紋導管直徑14～45 μm，有的具網(wǎng)狀三生增厚。纖維管胞單個散在或成束，長梭形。見圖3。

圖3 滇丹參粉末顯微圖

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1丹參酮ⅡA鑒別

2.3.1.1對照藥材溶液的制備取丹參對照藥材1 g，加乙醚15 mL，超聲10 min，放冷，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作為對照藥材溶液。

2.3.1.2對照品溶液的制備取丹參酮ⅡA 對照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3.1.3供試品溶液的制備取本品粉末（過30目篩）1 g，加乙醚15 mL, 超聲10 min，放冷，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作為供試品溶液。

2.3.1.4檢測方法照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部通則0502）試驗，吸取上述對照藥材、對照品和供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（6∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，結(jié)果見圖4。由圖可知，供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙紅色斑點；供試品色譜與丹參對照藥材色譜有明顯差異，說明不宜采用丹參對照藥材鑒別滇丹參中的丹參酮類成分，故選擇丹參酮ⅡA對照品進行定性鑒別。

圖4 不同批次滇丹參藥材的丹參酮ⅡA薄層鑒別色譜圖

2.3.2丹酚酸B鑒別

2.3.2.1對照品溶液的制備取丹酚酸B對照品，加75 %甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3.2.2供試品溶液的制備取本品粉末（過30目篩）0.4 g，加75 %甲醇25 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。

2.3.2.3檢測方法照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯一三氯甲烷一乙酸乙酯一甲醇一甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，結(jié)果見圖5。由圖可知，供試品色譜在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

圖5 不同批次滇丹參藥材的丹酚酸B薄層鑒別色譜圖

2.4 水分、灰分、浸出物檢查 按2015年版《中國藥典》方法測定［6］，結(jié)果見表2。10批滇丹參中水分含量為12.8 %～14.7 %；總灰分含量為6.5 %～9.4 %；酸不溶性灰分含量為0.7 %～1.6 %；水溶性浸出物含量為26.2 %～45.6 %；醇溶性浸出物含量為9.4 %～14.6 %。建議滇丹參質(zhì)量標準中水分不得過15.0 %；總灰分不得過10.0 %；酸不溶性灰分不得過3.0 %；水溶性浸出物不得少于25.0 %;醇溶性浸出物不得少于9.0 %。

表2 水分、灰分、浸出物含量測定結(jié)果

2.5 含量測定

2.5.1丹參酮ⅡA

2.5.1.1 色譜條件依利特 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-水（75∶25）為流動相；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃；流量1 mL/min；進樣5 μL。色譜圖見圖6。

圖6 丹參酮ⅡA HPLC色譜圖

2.5.1.2 對照品溶液的制備精密稱取丹參酮ⅡA對照品適量，加甲醇配制成26.4 μg/mL的對照品溶液。

2.5.1.3 供試品溶液的制備取本品粉末（過40目篩）約0.3 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加水10 mL，超聲處理5 min，濾過，濾渣與濾紙用水10 mL洗滌，濾干，棄去濾液與洗液，濾渣與濾紙置回同一錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.1.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取對照品溶液2、5、8、10、15、20 μL進樣，在“2.5.1.1”項下色譜條件測定。以色譜峰峰面積為縱坐標Y，對照品進樣量為橫坐標X（μg）繪制標準曲線，得回歸方程Y=5 980 885X-18 829，r=0.999 7。結(jié)果顯示樣品在0.052 8～0.528 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.1.5 精密度試驗取對照品溶液5 μL，在“2.5.1.1”項下色譜條件重復測定6次，測得丹參酮ⅡA峰面積RSD為0.65 %，表明儀器精密度良好。

2.5.1.6 重復性試驗取同一批樣品的供試品溶液5 μL，在“2.5.1.1”項下色譜條件重復測定6次，測得樣品中丹參酮ⅡA峰面積RSD為1.25 %，表明該方法重復性良好。

2.5.1.7 穩(wěn)定性試驗將供試品溶液分別于0、1、2、4、8、12 h，在“2.5.1.1”項下色譜條件進樣5 μL，測得樣品中丹參酮ⅡA峰面積RSD為1.16 %，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.1.8 加樣回收率精密稱取已知含量樣品6份，每份1.0 g，各加入1.0mg丹參酮ⅡA對照品，按“2.5.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率，丹參酮ⅡA平均回收率為99.47 %（RSD=1.11 %），表明方法的準確度符合要求（n=6），結(jié)果見表3。

表3 丹參酮ⅡA回收率試驗結(jié)果

2.5.1.9 樣品含量測定取10批樣品，每批約0.3 g，按“2.5.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1.1”項下色譜條件進行測定，計算含量，結(jié)果見表4。建議滇丹參質(zhì)量標準中含丹參酮ⅡA不得少于0.020 %。

表4 丹參酮ⅡA含量測定結(jié)果

2.5.2 丹酚酸B

2.5.2.1 色譜條件依利特 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）為流動相；檢測波長286 nm；柱溫30 ℃；流量1 mL/min；進樣10 μL。色譜圖見圖7。

圖7 丹酚酸B HPLC色譜圖

2.5.2.2 對照品溶液的制備精密稱取丹酚酸B對照品適量，加75 %甲醇配制成162 μg/mL的對照品溶液。

2.5.2.3 供試品溶液的制備取本品粉末（過40目篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75 %甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，稱重，用75 %甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.2.4 線性關(guān)系考察分別精密吸取對照品溶液2、5、8、10、15、20 μL進樣，在“2.5.2.1”項下色譜條件測定。以色譜峰峰面積為縱坐標Y，對照品進樣量為橫坐標X（μg）繪制標準曲線，得回歸方程Y=876 588X-7 794，r=0.999 9。結(jié)果顯示樣品在0.324～3.240 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2.5 精密度試驗取對照品溶液10 μL，在“2.5.2.1”項下色譜條件重復測定6次，測得丹酚酸B峰面積RSD為0.57 %，表明儀器精密度良好。

2.5.2.6 重復性試驗取同一批樣品的供試品溶液105 μL，在“2.5.2.1”項下色譜條件重復測定6次，測得樣品中丹酚酸B峰面積RSD為1.00 %，表明該方法重復性良好。

2.5.2.7 穩(wěn)定性試驗將供試品溶液分別于0、1、2、4、8、12 h，在“2.5.2.1”項下色譜條件進樣10 μL，測得樣品中丹酚酸B峰面積RSD為0.88 %，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.2.8 加樣回收率精密稱取已知含量樣品6份，每份0.1 g，各加入1.0 mg丹酚酸B對照品，按“2.5.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.2.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率，丹酚酸B平均回收率為99.65 %（RSD=1.06 %），表明方法的準確度符合要求（n=6），結(jié)果見表5。

表5 丹酚酸B回收率試驗結(jié)果

2.5.2.9 樣品含量測定取10批樣品，每批約1 g，按“2.5.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.2.1”項下色譜條件進行測定，計算含量，結(jié)果見表6。建議滇丹參質(zhì)量標準中含丹酚酸B不得少于1.50 %。

表6 丹酚酸B含量測定結(jié)果

3 討論

本實驗新增建立了滇丹參顯微鑒別方法，確定了根橫切面和粉末的顯微鑒別特征；發(fā)現(xiàn)不同硅膠板，不同溫、濕度對丹參酮類成分和丹酚酸類成分的薄層色譜鑒別展開效果影響不大，但丹參對照藥材不宜用于丹參酮類成分鑒別，故分別選擇丹參酮ⅡA對照品對丹參酮類成分進行定性鑒別；在《云南省中藥材標準（2005年版）》已有水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物等標準的基礎(chǔ)上，補充醇溶性浸出物標準，建議醇溶性浸出物不低于9.0 %；建立了滇丹參中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量測定方法，建議滇丹參質(zhì)量標準中含丹參酮ⅡA不得少于0.020 %，丹酚酸B不得少于1.50 %。