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    辣椒素對氧葡萄糖剝奪/再灌注所致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

    2021-10-11 01:59:20馬世江沈長波劉杰譚軍
    中醫(yī)藥信息 2021年9期
    關(guān)鍵詞:靶點(diǎn)試劑盒缺血性

    馬世江,沈長波,劉杰,譚軍

    (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    世界衛(wèi)生組織2014年發(fā)布的《世界衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)報(bào)告》顯示,全球每年約有670萬人死于卒中,卒中是世界第二大致死原因,也是永久性致殘的主要原因之一。其中,缺血性卒中占全部卒中事件中的80%~85%[1]。持續(xù)的缺血會(huì)導(dǎo)致腦組織損傷和壞死,恢復(fù)血液供應(yīng)雖然可以挽救缺血引起的可逆性損傷,但缺血/再灌注的過程同時(shí)也會(huì)引起腦組織和細(xì)胞的額外損傷,這種損傷是由一系列復(fù)雜的病理、生理因素導(dǎo)致的[1-2]。目前,能有效治療卒中的藥物很少,尋找新的治療方法勢在必行[3],開發(fā)新的神經(jīng)保護(hù)藥物對于有效治療缺血性損傷具有重要意義。

    辣椒素(Capsaicin,CAP)是一種酚類化合物(8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide),能選擇性地激活無髓鞘C 纖維,已廣泛應(yīng)用于疼痛的研究和治療中[4]。CAP 可以限制能量攝入,增加能量消耗,誘導(dǎo)胰島素分泌,降低血壓,減少脂質(zhì)儲(chǔ)存和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化病變。此外,CAP還有抗腫瘤活性,能減少過敏性氣道炎癥和緩解神經(jīng)源性膀胱癥狀等作用[5]。

    近年來,越來越多的研究表明,CAP對心肌的缺血再灌注(I/R)損傷具有保護(hù)作用。在大鼠心臟I/R 模型中,CAP 預(yù)處理可顯著降低心肌損傷[6-8]。另外,又有積累的證據(jù)表明CAP 具有神經(jīng)保護(hù)作用,CAP 可預(yù)防哇巴因誘導(dǎo)的大腦興奮性毒性、蒙古沙鼠全腦缺血、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失以及谷氨酸誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元損傷等[9-12]。這些研究進(jìn)一步擴(kuò)展了CAP 的潛在臨床應(yīng)用。然而,目前對于CAP 神經(jīng)保護(hù)作用的潛在機(jī)制研究卻很少。在本實(shí)驗(yàn)中,筆者通過使用體外神經(jīng)元培養(yǎng),檢測CAP 對神經(jīng)元I/R 損傷的直接作用,并對其潛在的分子機(jī)制進(jìn)行研究。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    辣椒素(Sigma 公司);尼莫地平注射液(青島金峰制藥有限公司);L-NAME,LY294002(Sigma 公司);MTT(北京索萊寶科技有限公司);Hoechst 33342(碧云天生物技術(shù)有限公司);LDH檢測試劑盒、Caspase-3和Caspase-9活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);PrimeScript?RT reagent Kitwith gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量試劑盒(大連寶生物工程有限公司);SpectraMax M3 多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司);LighCAPycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞典羅氏公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分組及氧葡萄糖剝奪/再灌注(OGD/R)損傷實(shí)驗(yàn)

    SH-SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞每2~3 d 換液1 次。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N在96孔板或6孔板上。

    將細(xì)胞隨機(jī)分為6 組:正常組,模型組,尼莫地平組和CAP 低、中、高劑量組。為了模擬體外I/R 條件,除正常組仍常規(guī)培養(yǎng)外,對其余5 組SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行OGD/R 處理。細(xì)胞用無葡萄糖Earle 的平衡鹽溶液洗滌2 次,將培養(yǎng)基替換為EBSS,然后,將細(xì)胞移入含有5% CO2和95% N2的混合氣體的培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)4 h。經(jīng)過OGD 處理后,換成正常培養(yǎng)基,放入含5% CO2的正常培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24 h。在整個(gè)OGD/R 過程中,給予尼莫地平組5 μg/mL 的尼莫地平,分別給予CAP 低、中、高劑量組1、5、25 μmol/L 的CAP。

    1.3 細(xì)胞活力評(píng)估及Hoechst 33342 染色觀察凋亡細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化

    將MTT(5 mg/mL,20 μL/孔)添加到96 孔板(約6×103/孔)中作用4 h。然后,將生成的藍(lán)色甲酰胺還原產(chǎn)物(活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶對染料的作用)溶解在150 μL二甲基亞砜中,使用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取其吸光度。

    細(xì)胞接種于6 孔板,分組處理后,吸去培養(yǎng)液,每孔加入4%多聚甲醛0.5 mL,4 ℃固定30 min。吸去固定液,加入PBS 洗滌2 遍,每次3 min,然后把液體吸凈。每孔加入Hoechst 33342染色液0.5 mL,避光染色10 min,中間手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。之后再用PBS 洗滌2 遍,每次3 min。熒光顯微鏡下拍照觀察。

    1.4 LDH漏出檢測

    當(dāng)細(xì)胞受到OGD/R 損傷時(shí),細(xì)胞內(nèi)的LDH 會(huì)迅速釋放到培養(yǎng)上清液中。細(xì)胞損傷情況用LDH檢測試劑盒測定。采集培養(yǎng)的SH-SY5Y 細(xì)胞的上清液,3 000 ×g離心10 min,按說明書要求進(jìn)行處理。在450 nm處檢測吸光度。

    1.5 Caspase-3、Caspase-9活性檢測

    使用Caspase-3、Caspase-9 活性檢測試劑盒進(jìn)行檢測,嚴(yán)格按說明書要求操作。胰酶消化貼壁細(xì)胞,并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中。4 ℃,600 ×g離心5 min,收集細(xì)胞,小心吸除上清液,PBS 洗滌1 次。每200 萬細(xì)胞加入100 μL 裂解液,重懸沉淀,冰浴裂解15 min。4 ℃,16 000 ×g離心10 min。把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。立即測定Caspase-3、Caspase-9的酶活性或-70 ℃保存樣品待測。

    1.6 實(shí)時(shí)熒光定量檢測Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)

    使用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)測定A260 和A280,計(jì)算RNA 濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光定量TB Green?Premix Ex Taq ?Ⅱ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。 引物序列為:Bax 上游為5′ -AGCGACTGATGCAGCCTGCAGT-3′,下游為5′ -CCAGAGCCCACAGTCAGTTCCAG-3′;Bcl-2 上游為5′-ATGTGTGTGGAGAGCGCAGAA -3′,下游為5′-ACAGTCAPCACAAAGGCACAPC-3′;β-actin 上游為5′-AGCGAGCACAGCCCCAAAGTT-3′,下游為5′-GGGCACGAAGGCCAGACAGATT-3′。反應(yīng)條件如下:先95 ℃30 s預(yù)變性,隨后95 ℃5 s,60 ℃20 s,共循環(huán)40次。按照2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。

    1.7 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討CAP 治療缺血性卒中的潛在分子作用機(jī)制

    1.7.1 CAP 潛在作用靶點(diǎn)及缺血性卒中相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

    分別采用TCMSP、drug bank、DGldb、CTD 和Swiss target prediction 數(shù)據(jù)庫檢索及預(yù)測CAP 的靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)合并,用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將蛋白質(zhì)名稱轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛎Q,去除重復(fù)的靶點(diǎn)。

    以cerebral ischemic stroke 和cerebral infarction 作為關(guān)鍵詞搜索drug bank、OMIM、GENE CARD、Disgenet和TTD 數(shù)據(jù)庫獲得缺血性卒中相關(guān)靶點(diǎn),選擇人源靶點(diǎn),將所有靶點(diǎn)合并,去除重復(fù)靶點(diǎn)。

    1.7.2 CAP 抗缺血性卒中作用靶點(diǎn)的獲得及功能富集分析

    將缺血性卒中疾病相關(guān)靶點(diǎn)和CAP 潛在靶點(diǎn)取交集,得出藥物和疾病間的共同靶點(diǎn),即CAP 抗缺血性卒中作用靶點(diǎn)。

    功能富集分析包括基因本位(GO)生物過程富集分析和KEGG 通路的富集分析。GO[包括生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)]和KEGG 途徑富集分析是描述候選靶點(diǎn)特征的常用方法。在本研究中,采用DAVID(https://david.nicifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(高通量功能注釋生物信息學(xué)的在線平臺(tái))對CAP 抗缺血性卒中作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路分析。

    1.7.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

    1.7.3 .1 CAP介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

    為了確定PI3K是否參與了CAP的神經(jīng)保護(hù)作用,在96 孔板(每孔6 × 103個(gè)細(xì)胞)中加入CAP 前1 h,向細(xì)胞中添加抑制劑(LY294002,10 μmol/L)。然后用MTT法測定其存活率。

    1.7.3 .2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測PI3K、AKT mRNA的表達(dá)

    使用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光定量TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。 引物序列為:PI3K 上游為5′ -CGAGGTTTTGCTGTTCGGTG-3′,下游為5′ -CAGGCCAAACCTCTGGCTAA-3′;Akt 上游為5′-CAGGATGTGGACCAACGTGA -3′,下游為 5′ -AAGGTGCGTTCGATGACAGT-3′;β-actin 上游為5′-AGCGAGCACAGCCCCAAAGTT-3′,下游為5′-GGGCACGAAGGCCAGACAGATT-3′。按照2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 19.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CAP對細(xì)胞活力的影響

    與正常組相比,模型組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)。而與模型組相比,CAP 中、高劑量組能顯著升高OGD/R 細(xì)胞的活力(P<0.05,P<0.01),而CAP 低劑量組的作用則不明顯。見圖1。

    圖1 OGD/R干預(yù)下CAP對細(xì)胞活力的影響

    2.2 CAP對SH-SY5Y細(xì)胞核形態(tài)的影響

    Hoechst 33342 染色后,正常組細(xì)胞的細(xì)胞核染色較均勻,形態(tài)接近,熒光彌散。模型組出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞,凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核由于核濃集、固縮,呈團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu),熒光染色不均勻,另有些核呈分葉、碎片狀。而與模型組相比,尼莫地平組和CAP 高劑量組凋亡細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞形態(tài)接近正常。見圖2。

    圖2 CAP對SH-SY5Y細(xì)胞核形態(tài)的影響(Hoechst 33342染色,×400)

    2.3 CAP對LDH水平、Caspase-3和Caspase-9活性的影響

    與正常組相比,模型組LDH 水平和Caspase-3、Caspase-9 活性均顯著升高(P <0.01);與模型組比較,CAP 中、高劑量組LDH 水平明顯降低(P <0.05,P <0.01),Caspase-3、Caspase-9 活性也明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

    表1 CAP對LDH 水平、Caspase-3、Caspase-9活性的影響(±s)

    表1 CAP對LDH 水平、Caspase-3、Caspase-9活性的影響(±s)

    注:與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    Caspase-9 100 212.64±29.08##149.83±16.43**193.27±18.63 168.97±23.45*134.60±15.56**組別正常組模型組尼莫地平組CAP低劑量組CAP中劑量組CAP高劑量組n3 3 3 3 3 3 LDH 100 234.57±28.83##143.34±19.87**207.32±31.56 179.84±29.54*148.85±31.42**Caspase-3 100 249.57±31.87##158.88±19.98**218.58±27.54*195.17±16.08*167.41±24.76**

    2.4 CAP對Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

    與正常組相比,模型組Bax mRNA 表達(dá)顯著升高(P <0.01),Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著下降(P <0.01)。與模型組比較,CAP 中、高劑量組能明顯增加Bcl-2 mRNA 表達(dá),降低Bax mRNA 表達(dá)(P <0.05,P <0.01),而CAP 低劑量組的作用則不明顯。見表2。

    表2 CAP對Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響(±s)

    表2 CAP對Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響(±s)

    注:與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    Bax/β-actin 1 1.71±0.31##1.42±0.16**1.63±0.17 1.52±0.21*1.38±0.19**組別正常組模型組尼莫地平組CAP低劑量組CAP中劑量組CAP高劑量組n3 3 3 3 3 3 Bcl-2/β-actin 1 0.52±0.05##0.83±0.07**0.61±0.05 0.73±0.04*0.80±0.06**

    2.5 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討CAP 治療缺血性卒中的潛在作用機(jī)制

    2.5.1 CAP 的潛在靶點(diǎn)預(yù)測及缺血性卒中疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選結(jié)果

    分別采用TCMSP、drug bank、DGldb、CTD 和Swiss target prediction 數(shù)據(jù)庫檢索及預(yù)測CAP 的靶點(diǎn)。剔除非人源靶點(diǎn),去除重復(fù)的靶點(diǎn),共獲得了90 個(gè)CAP 活性成分的靶點(diǎn),包括AKT1、VEGFA、BCL2、CASP3、MAPK1、FOS、PTGS2等。

    通過drug bank、GENE CARD、OMIM、TTD、Disgenet數(shù)據(jù)庫檢索缺血性卒中疾病相關(guān)靶點(diǎn),靶點(diǎn)合并,去除重復(fù)靶點(diǎn),建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。共獲得1 552個(gè)缺血性卒中的疾病相關(guān)靶點(diǎn),包括ALDH2、ABO、ZFHX3、ACTA2、PROCR、PDE3A、LOX、COL4A1等。

    2.5.2 藥物疾病共同靶點(diǎn)及共同靶點(diǎn)的功能富集分析

    將預(yù)測的90個(gè)CAP 活性成分的靶點(diǎn)和1 552個(gè)缺血性卒中的疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集,得出藥物疾病共同靶點(diǎn)59 個(gè),即為CAP 抗缺血性卒中作用靶點(diǎn)。見圖3、圖4。

    圖3 CAP預(yù)測靶點(diǎn)和缺血性卒中靶點(diǎn)交集的韋恩圖

    圖4 CAP治療缺血性卒中的潛在靶點(diǎn)

    GO 通路分析結(jié)果表明,其生物學(xué)過程(BP)主要富集于認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶、肽基絲氨酸磷酸化等。細(xì)胞成分(CC)主要富集于神經(jīng)元細(xì)胞體、突觸前膜的組成成分、膜筏等。分子功能(MF)主要富集于血紅素結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。見圖5。

    圖5 CAP抗缺血性卒中主要有效成分靶點(diǎn)GO通路富集

    此外,筆者還進(jìn)行了KEGG 途徑分析,用以探討CAP 抗缺血性卒中的生物學(xué)途徑。富集顯著的前5 個(gè)信號(hào)通路依次為PI3K/Akt 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號(hào)通路、HIF-α 信號(hào)通路和TNF-α 信號(hào)通路。其中PI3K/Akt 信號(hào)通路富集最顯著。見圖6。

    圖6 CAP抗缺血性卒中主要有效成分靶點(diǎn)KEGG通路富集

    2.5.3 PI3K介導(dǎo)的CAP神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

    為了確定PI3K 是否參與保護(hù)SH-SY5Y 細(xì)胞在OGD/R 作用下的生存能力,在OGD/R 過程中用CAP 和LY294002(阻斷PI3K)處理細(xì)胞,結(jié)果表明在OGD/R期間抑制PI3K 顯著降低了CAP 的保護(hù)作用。此外,LY294002對細(xì)胞無影響。見圖7。

    圖7 OGD/R干預(yù)下PI3K(B)抑制劑對CAP的細(xì)胞活性保護(hù)作用的影響

    2.5.4 CAP對PI3K、Akt mRNA的表達(dá)的影響

    與正常組相比,CAP 中、高劑量組可顯著增加PI3K、Akt mRNA 表達(dá)水平(P< 0.05,P< 0.01),而GAP低劑量組的作用則不明顯(P>0.05)。見圖8。

    圖8 CAP對PI3K,Akt mRNA表達(dá)的影響

    3 討論

    作為缺血的體外模型,OGD/R 模型廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生化變化以及腦缺血損傷機(jī)制的體外研究中[13]。細(xì)胞活性在評(píng)價(jià)神經(jīng)保護(hù)藥物治療缺血性腦疾病的有效性中起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),在缺血損傷的SHSY5Y 細(xì)胞模型中,用CAP 治療可顯著增加細(xì)胞的MTT 檢測的OD 值,這一研究結(jié)果表明,CAP 對OGD/R誘導(dǎo)的損傷具有保護(hù)作用。LDH 是一種參與乳酸產(chǎn)生的糖酵解酶,存在于各種組織的細(xì)胞漿中。LDH 的釋放與細(xì)胞膜完整性的破壞有關(guān),通常被看作細(xì)胞毒性的指標(biāo)[14]。LDH 水平的升高表明細(xì)胞膜完整性降低。在本研究中,CAP 預(yù)處理可顯著降低OGD/R 損傷后的LDH 釋放率。因此,CAP 可以保護(hù)細(xì)胞膜完整性免受OGD/R誘導(dǎo)的損傷。

    腦缺血可誘導(dǎo)凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá),如Bax 和Bcl-2。腦缺血損傷相關(guān)的細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腦I/R 后細(xì)胞死亡的主要機(jī)制之一[15]。Bax 是一種凋亡前蛋白,與Bcl-2具有顯著的序列同源性,激活Bax可加速細(xì)胞程序性死亡[16]。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白,能阻止細(xì)胞色素C 釋放到細(xì)胞質(zhì)中,這是細(xì)胞凋亡過程中的重要步驟[17]。Bcl-2 和Bax 通過形成同二聚體和異二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。Bax 的過度表達(dá)可導(dǎo)致同二聚體的形成,誘導(dǎo)凋亡。相反,過度表達(dá)Bcl-2 可導(dǎo)致異二聚體的形成,從而抑制Bax 異二聚體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。因此,Bcl-2/Bax 的比值能夠調(diào)節(jié)腦缺血損傷引起的細(xì)胞凋亡。已知在Caspase家族中,特別是Caspase-3 和Caspase-9 活性,在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行中起著中心作用[19]。在本研究中,OGD/R 模型組Caspase-3 和Caspase-9 活性增高以及Bax mRNA 的上調(diào)、Bcl-2 mRNA 的下調(diào)共同導(dǎo)致了凋亡事件,而CAP 治療可抑制缺血損傷后Caspase-3 和Caspase-9活性升高及Bax mRNA 的上調(diào),Bcl-2 mRNA 表達(dá)增強(qiáng)。這些結(jié)果表明,CAP 對OGD/R 所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。

    為了進(jìn)一步闡明CAP 的藥理機(jī)制,筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,對CAP 治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科,建立在系統(tǒng)生物學(xué)的一般概念之上[20],常用于系統(tǒng)評(píng)價(jià)多成分藥物的藥理作用[21]。此外,最近也有研究提供了類似的方法來揭示各種復(fù)雜慢性疾病的分子機(jī)制,如神經(jīng)病變和心腦血管疾病[22]。因此,基于大量現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)絡(luò)分析可以初步了解多靶點(diǎn)藥物治療復(fù)雜疾病的機(jī)制。本文先使用TCMSP、drug bank、DGldb 和CTD 數(shù)據(jù)庫檢索并使用Swiss target prediction 預(yù)測了CAP 的靶點(diǎn),并使用drug bank、OMIM、GENE CARD、Disgenet 和TTD 數(shù)據(jù)庫獲得缺血性卒中相關(guān)靶點(diǎn),二者取交集,即CAP 抗缺血性卒中作用靶點(diǎn)。筆者對59 個(gè)CAP 治療缺血性卒中的靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG 途徑分析,以此探討CAP 抗缺血性卒中的生物學(xué)途徑。富集顯著的前5 個(gè)信號(hào)通路依次為PI3K/Akt 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號(hào)通路、HIF-α 信號(hào)通路、TNF-α 信號(hào)通路。其中PI3K/Akt 信號(hào)通路富集最顯著。

    研究表明,在生理和病理生理?xiàng)l件下,磷酸肌醇-3-激酶/Akt(PI3K/Akt)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和存活中起著核心作用[23],并且PI3K/Akt 途徑在缺血誘導(dǎo)的凋亡中起著重要作用[24]。已有研究證實(shí),PI3K/Akt 途徑能夠上調(diào)抗凋亡蛋白并下調(diào)凋亡前蛋白[25]。在本研究中,筆者使用PI3K 抑制劑LY294002 來確定PI3K 激活是否參與了SH-SY5Y 細(xì)胞中OGD/R 損傷下的CAP的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果顯示,LY294002可以消除由CAP 誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用,同時(shí)與正常組相比,CAP 中、高劑量組可顯著增加PI3K、Akt mRNA 的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01),這些均提示CAP 的神經(jīng)保護(hù)作用是通過激活PI3K/AKT通路來實(shí)現(xiàn)的。

    綜上,本研究證實(shí)了CAP 對OGD/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。CAP 能減輕OGD/R 誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞損傷,減少細(xì)胞凋亡,這可能與激活PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。由于腦I/R 損傷涉及多種信號(hào)通路的激活,其發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜,CAP是否還對別的通路如cAMP 信號(hào)通路等存在影響,仍有待進(jìn)一步的研究。

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