基于代謝組學的川楝子亞急性毒性機制初探

烏日漢，陳玉花，麗麗，畢力格，孟香花，寶樂爾，韓曉靜，肖田梅，白梅榮*

（1.內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古民族大學化學與材料學院，內蒙古 通遼 028000）

川楝子是楝科植物川楝的干燥成熟果實，蒙藥名為巴茹日，異名為布和·查干·毛敦乃·烏熱，味澀、苦，性涼，效輕、淡、燥、鈍，有小毒，具有清巴達干、希拉、燥熱性希拉烏素、殺蟲止痛及明目等功效，普遍用于治療熱性希拉烏素病、巴達干希拉合并癥、脫發(fā)、皮膚瘙癢、濕疹、白癜風、陶賴、赫如虎、濁熱、新陳熱等多種疾?。?］。現(xiàn)代研究證實其具有驅蟲、抗氧化、抗菌、抗血栓、消炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用［2］。但其有毒，使應用受限。目前川楝子毒性研究較少，是否與其內源性代謝物相關尚不清楚。

代謝組學是反映機體狀況的小分子代謝物的變化及其功能之間的關系［3］，現(xiàn)已普遍應用于毒理學和藥物安全評價，可以發(fā)現(xiàn)損傷的發(fā)生、發(fā)展和消失過程中的生物標志物，從而揭示毒性靶器官，闡明毒性機制［4］?？诜幬锉淮x酶代謝后會出現(xiàn)生物活性減少而療效減弱和生物活性增大而放大療效兩種現(xiàn)象。川楝子的毒性成分吸收過多而減弱療效將會產生毒性，以肝臟毒性尤為顯著［5］。在毒性－藥效尚未分辨清楚的前提下，為用藥安全起見，首要明確該藥與內源性代謝物之間的相關性。本研究用LC－MS 技術，分析蒙藥川楝子對大鼠小分子代謝物的改變情況，探討其亞急性毒性作用和可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD 雄性大鼠，SPF 級，體質量（200±20）g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，批號：SCXK（遼）2015－0001。飼養(yǎng)環(huán)境SPF 級，光照12 h；動物房內24 h維持溫度（23±1）℃，自由飲水，進食。

1.2 藥品與試劑

川楝子（內蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室）；血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHO）、尿素氮（UREAL）、肌酐（CREA）試劑盒（上海羅氏診斷產品有限公司）；純化水（屈臣氏集團有限公司）；質譜乙腈（美國Thermo Fisher Scientific公司）；甲酸（美國Sigma－Aldrich公司）。

1.3 儀器

質譜儀MASS（TripleTOF5600+，AB SCIEX?）；臺式高速冷凍離心機（Mikro 220R，Hettich）；羅氏cobas c 311全自動生化分析儀［羅氏診斷產品（上海）有限公司］；移液器（Eppendorf N13462C，德國Eppendorf公司）；粉碎研磨儀（TL－48R，上海萬柏生物科技有限公司）；色譜UHPLC（Nexera UHPLC LC－30A，島津SHIMADZU）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及取材

取大鼠32 只，隨機分為正常組、川楝子高劑量組（川高組）、川楝子中劑量組（川中組）和川楝子低劑量組（川低組），每組8 只。川高組給藥劑量為2.571 4 g/kg（臨床等效劑量2 倍），川中組給藥劑量為1.285 7 g/kg（臨床等效劑量），川低組給藥劑量為0.642 9 g/kg（臨床等效劑量1/2 倍）。自實驗開始，給藥組給予相應的藥物溶液灌胃，每日1 次，連續(xù)21 d；正常組灌胃等量生理鹽水。末次給藥后，麻醉動物，取血分離血清，置于－80 ℃保存?zhèn)溆?，待測肝、腎相關生化指標。采集同一部位肝、腎組織置凍存管儲存?zhèn)錂z。

2.2 代謝物提取

血清樣本于4 ℃解凍后，取100 μL 加入300 μL 甲醇，震蕩提取于12 000 rpm，4 ℃下離心10 min，取上清液進樣10 μL，用UPLC－MS檢測。

分別稱取腎臟和肝臟組織50 mg 左右，向PE 管中加入1 000 μL 甲醇，研磨器研磨至勻漿，離心15 min（4 ℃，12 000 rpm），取上清液進樣10 μL。

2.3 UPLC－MS檢測

采用Waters BEH HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為流動相A（0.1%甲酸水，乙酸銨）和B（乙腈），柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL。洗脫梯度：0～16 min，95%～50% B；16～20 min，50% B；20～21 min，50%～95%B；21～22.5 min，95%B。

質譜參數(shù)條件：采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測。ESI 源條件如下，離子源Gas1：50，離子源Gas2：50，氣簾氣壓力（CUR）：25，界面加熱溫度：500 ℃（正離子）和450 ℃（負離子），離子噴霧電壓浮動（ISVF）：5 500 V（正離子）和4 400 V（負離子），TOF 質量掃描范圍：100～1 200 Da，產物離子掃描范圍：50～1 000 Da，TOF MS 掃描累積時間0.2 s，產物離子掃描累積時間0.01 s，二級質譜采用information dependent acquisition（IDA）獲得，并采用high sensitivity模式，去簇電壓（DP）：±60 V，碰撞能量：（35±15）eV。

2.4 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗、秩和檢驗、單因素方差分析分別進行組間比較。P< 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

利用Analysis Base File Converter 軟件將獲得的原始數(shù)據(jù)轉換成ABF 格式，再導入MS－DIAL 4.10 軟件進行預處理。使用MassBank、Respect、GNPS 數(shù)據(jù)庫進行比對。分析各組樣本采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析法（OPLS－DA）。篩選VIP≥1和FC> 1.5（或< 0.5）及P≤0.05 作為差異代謝物。再使用MetaboAnalyst 4.0分析代謝通路。

3 結果

3.1 肝、腎生化指標檢測結果

給藥第7 天，與正常組比較，川高組、川中組的ALT 和AST 呈上升趨勢。給藥第14 天，與正常組比較，川高組ALT 和AST 顯著升高（P< 0.05），川中組、川低組AST顯著升高（P<0.05），川低組UREA、CREA下降（P<0.01）。結果見圖1。

圖1 給藥第7天、第14天血清肝腎功能生化指標結果比較

給藥第21天，與正常組比較，川高組ALT和AST顯著升高（P<0.05），川低組AST顯著下降（P<0.01）；與正常組比較，川高、川中、川低組CHO、TP顯著下降（P<0.05）；川中組TG顯著升高（P<0.05），CREA下降（P<0.05）。提示，川楝子對肝臟具有一定的毒性。血清TG升高，CHO、TP降低，可能是營養(yǎng)和吸收能力減弱，也提示肝功能受損，腎功能紊亂。結果見表1。

表1 各組大鼠血清肝、腎功能生化指標比較（±s，n=8）

表1 各組大鼠血清肝、腎功能生化指標比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別正常組川高組川中組川低組TP（g/L）61.25±7.31 49.07±8.12**47.33±4.86**46.73±6.60**ALT（U/L）37.43±7.90 60.46±16.57**44.04±7.74 35.32±10.89 AST（U/L）109.9±13.22 149.58±48.42*124.33±28.44 87.17±16.32**TG（U/L）0.43±0.17 0.39±0.24 0.57±0.15*0.40±0.14 UREA（mmoL/L）6.80±2.40 8.47±3.43 5.48±0.95 4.96±1.47 CREA（umol/L）40.00±7.15 37.57±6.24 32.44±6.69*34.00±8.29 CHO（mmoL/L）1.64±0.30 1.25±0.27*1.27±0.17**1.18±0.23**

3.2 PCA

PCA 通過主要新變量對各組數(shù)據(jù)進行歸類，去除重復性差和異常樣本，可觀察樣品的聚集、離散程度。根據(jù)圖2～4，正常組（8）與川楝子組（1）的大鼠血清、肝、腎代謝物呈分離趨勢，說明代謝物具有一定的差異。利用Metabo Analyst 軟件進行聚類分析，以熱圖的聚類結果分析組間差異，顏色深淺表示代謝物水平，紅色為升高、藍色為降低。根據(jù)圖5～7，正常組與川高組的代謝物相對豐度呈有明顯差異。表明川楝子可使大鼠血清、肝、腎代謝物產生一定變化。

圖2 血清代謝物PCA

圖3 肝代謝物PCA

圖4 腎代謝物PCA

圖5 血清代謝物熱圖

圖6 肝代謝物熱圖

圖7 腎代謝物熱圖

3.3 OPLS－DA

OPLS－DA作為一種有監(jiān)督的分析方法，能夠篩選出差異代謝物。根據(jù)圖8～10，正常組大鼠血清、肝、腎代謝物與川楝子組完全分離，說明代謝物譜有顯著差異。通過參數(shù)檢驗進行OPLS－DA模型驗證，具有良好的準確率和預測率（參數(shù)R2Y和Q2均>0.5）。

圖8 血清OPLS－DA的S－plot圖

圖9 肝OPLS－DA的S－plot圖

圖10 腎OPLS－DA的S－plot圖

3.4 差異代謝物的篩選

3.4.1 血清差異代謝物的篩選

為尋找潛在差異代謝物，采用OPLS－DA 中VIP≥1 和P<0.05，且fold change>1.5（或<0.5）的標準篩選，通過MassBank、Respect、GNPS 數(shù)據(jù)庫進行檢索分析。川楝子組血清樣本中篩出10 個差異代謝物。與正常組（8）比較，川楝子組（1）吡咯－2－羧酸、纈氨酸、膽紅素、LPC 18∶2、LPC 16∶0、LPC 18∶1 明顯上升，肉堿、sn－甘油－3－磷酸膽堿、胸腺嘧啶－β－D－葡萄糖苷、［5－乙酰氧基－3－（羥甲基）－2－氧基－6－丙烷－2－基環(huán)己－3－烯－1－烯基］3－甲基戊酸酯明顯下降，見表2。

表2 血清差異代謝物鑒定

3.4.2 肝臟差異代謝物的篩選

肝臟樣本中鑒定出20 個差異代謝物。與正常組比較，川楝子組賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、蛋氨酸亞砜、甲芬那酸、4，5－二氯－2－正辛基－l－3（2H）－異噻唑啉酮（DCOIT）、表沒食子兒茶素、一磷酸腺苷、S－腺苷－L－同型半胱氨酸、S－（5′－腺苷）－L－同型半胱氨酸、LPE 18∶1、谷氨酰胺（D）顯著下降，N－乙酰－D－氨基葡萄糖、胞嘧啶核苷、3－（5－甲氧基－2，2－二甲基鉻－8－甲基）－3－氧丙二酸、黃嘌呤核苷、異麥芽酮糖、蜜二糖、鄰苯二甲酸二（2－乙基己基）酯（DEHP）顯著上升，見表3。

表3 肝臟差異代謝物鑒定

3.4.3 腎臟差異代謝物的篩選

腎臟樣本中發(fā)現(xiàn)了12 個差異代謝物。與正常組比較，川楝子組1－O－十六烷基－2－C－甲基－3－磷脂酰膽堿、谷氨酰胺（D）、果糖、尿嘧啶、亞油酸、黃嘌呤核苷、谷胱甘肽（還原）、胸腺嘧啶－β－D－葡萄糖苷明顯上升，天冬氨酸、4－甲基苯甲酰乙酸酯、LPE 16∶0、LPE 18∶1明顯下降，見表4。

表4 腎臟差異代謝物的篩選

3.5 差異代謝物通路分析

將篩選出的差異代謝物導入MBRole 2.0 進行通路富集分析。血清差異代謝物涉及ABC 轉運蛋白、蛋白質消化吸收、嘧啶代謝、精氨酸生物合成、氨基酸的生物合成、癌癥的中心碳代謝、氨酰－tRNA 合成代謝、嘌呤代謝、FoxO 信號通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等通路，見圖11。肝臟差異代謝物主要與ABC 轉運蛋白、維生素消化吸收、膽固醇代謝、嘧啶代謝、嘌呤代謝、膽汁分泌、代謝途徑、精氨酸和脯氨酸的代謝、煙酸和煙酰胺代謝、精氨酸生物合成等通路顯著相關，見圖12。腎臟差異代謝物與ABC 轉運蛋白、嘌呤代謝、精氨酸和脯氨酸的代謝、代謝途徑、蛋白質消化吸收、嘧啶代謝、氨酰－tRNA 合成代謝、癌癥的中心碳代謝、酒精中毒、氨基酸的生物合成等通路相關，見圖13。結果發(fā)現(xiàn)，血清、肝、腎代謝物均與ABC 轉運蛋白相關性最強，其次為氨基酸代謝、嘌呤代謝。

圖11 血清樣品代謝通路氣泡圖

圖12 肝臟樣品代謝通路氣泡圖

圖13 腎臟樣品代謝通路氣泡圖

4 討論

川楝子含小毒，故其在臨床應用上備受限制。本研究以大鼠為研究對象，以川楝子為示例藥物，檢測肝腎常規(guī)指標對其進行評價，并基于代謝組學方法對大鼠血清、肝、腎組織樣本進行代謝輪廓分析，揭示其亞急性毒性作用和作用機制。

本試驗中，川楝子能明顯增加ALT、AST 活性。血清ATL、AST 是評估肝細胞損傷狀態(tài)的最靈敏指標。說明川楝子的毒性已造成大鼠肝臟損傷和功能障礙。

Crea、Urea 能反映腎小球濾過功能的受損程度，是腎功能變化的一項常用指標。本試驗中，川楝子從用藥第14天起可降低Crea、Urea水平（P<0.05），可能是由于大鼠各系統(tǒng)處于高代謝狀態(tài)，使腎小球清除率提高所致；同時川楝子可在胃腸道吸附肌酐，增加排泄量，使得血肌酐降低，實驗結果提示可能與其給藥劑量緊密相關。血清TG升高常見于腎功能低下，肝實質性病變［6］。血清CHO 和TP 降低可能原因是營養(yǎng)及吸收障礙，肝臟合成蛋白能力下降、肝功能受損，腎病綜合征等［7］。TP 含量減少多為腎功能下降，因血中蛋白的丟失，會紊亂肝臟蛋白質脂質代謝，也增加TG 的合成［8］。本試驗中，川楝子可升高TG 含量（P<0.05），同時降低CHO、TP含量（P<0.05），可能是腎功能下降和肝功能異常所致。結果提示，不同條件下肝臟對川楝子毒性作用的敏感性比腎臟高。

通過代謝組學技術，分別鑒定出血清、肝臟、腎臟差異代謝物10、20、12 種，這些代謝物的變化可能與其毒性密切相關。代謝通路富集分析顯示，血清、肝、腎差異代謝物均涉及ABC 轉運蛋白、嘌呤代謝、氨基酸代謝、嘧啶代謝等代謝通路。

ABC 轉運蛋白是體內最廣泛存在的蛋白家族之一。需要消耗ATP 而參與氨基酸、葡萄糖、代謝物、肽段、藥物和帶電離子等物質的跨膜運輸［9］。ABC 轉運蛋白代謝途徑主要與肉堿、N－乙酰－D－氨基葡萄糖、蜜二糖等有關，這些代謝物的變化可能會導致ABC轉運蛋白代謝通路的變化。研究表明，肉堿能增加大鼠肝組織線粒體抗氧化酶活性，降低或維持脂質過氧化物水平［10－11］。川楝子能使肉堿含量下降，說明川楝子能促進大鼠肝組織的氧化供能，打破脂質過氧化平衡，進而影響三羧酸循環(huán)。N－乙酰－D－氨基葡萄糖是氨基糖的生化前體，可提高免疫功能，防止纖維細胞的過度增殖［12］。其水解酶NAG－ase 水平能反映肝實質損害程度［13］。由此推斷，代謝物水平失衡是川楝子產生肝臟毒性的主要機制之一。

氨基酸是生物體系代謝和生理作用的重要物質。肝臟是機體進行氨基酸代謝的關鍵場所，當其損傷會使氨基酸代謝受到影響，減少肝細胞內的氨基酸合成［14］。其中，甲硫氨酸是一種必需氨基酸，參與谷胱甘肽合成、甲基化反應過程。甲硫氨酸的異常下降會誘發(fā)肝臟輕微脂肪變性，從而影響肝臟脂質代謝［15］。谷氨酸存在于肝腎組織，催化最終生成α－酮戊二酸，這對肝臟內的氨基酸代謝至關重要，也是三羧酸循環(huán)的關鍵［16］。川楝子組可明顯降低谷氨酸水平，提示肝細胞受損。賴氨酸參與機體蛋白質的合成并影響能量代謝，在乙酰輔酶A 作用下分解成α－酮戊二酸，進入三羧酸循環(huán)［17］。三羧酸循環(huán)是體內糖、脂、蛋白質等能量與物質轉化代謝的中心環(huán)節(jié)，從而影響糖、脂類及氨基酸的含量。川楝子可引起大鼠體內氨酸代謝物的改變，提示氨基酸代謝失衡可能與肝腎毒性息息相關。

嘌呤和嘧啶代謝與腎病的發(fā)展緊密相關［18］。嘌呤代謝為生物合成提供能量和輔助因子，在泌尿系結石、尿酸生成中有著重要影響［19］。嘌呤是生物體內一種重要的堿基。黃嘌呤是體內嘌呤堿基之一，也是嘌呤代謝后的產物，由嘌呤堿氧化生成黃嘌呤，再進一步氧化為尿酸。肝臟和腎臟是嘌呤代謝的主要部位，其中肝臟是嘌呤從頭合成代謝的重要場所。研究表明，肝臟受損時黃嘌呤氧化酶減少，妨礙黃嘌呤轉化為尿酸的代謝，使血尿酸形成過少，影響黃嘌呤的排泄［20］。嘌呤代謝途徑中黃嘌呤核苷的升高，可能與腫瘤組織的增殖需求及腫瘤環(huán)境中嘌呤代謝途徑的變化有關［21］。川楝子能使黃嘌呤核苷上調，提示嘌呤代謝途徑的改變可能與肝腎毒性密切相關。嘧啶的從頭合成代謝途徑是癌細胞和免疫細胞主要依賴場所［22］。胞嘧啶和尿嘧啶是嘧啶的主要衍生物。本研究發(fā)現(xiàn)，川楝子組胞嘧啶核苷和尿嘧啶代謝物含量升高，可能會造成嘧啶代謝途徑的變化，引發(fā)肝腎毒性。

綜上所述，川楝子可明顯改變大鼠體內代謝物水平，從而導致體內一系列代謝途徑失衡，以2.571 4 g/kg（臨床等效劑量2 倍）、1.285 7 g/kg（臨床等效劑量）、0.642 9 g/kg（臨床等效劑量1/2 倍）劑量口服川楝子，從第14 天起均可產生一定的肝毒性和潛在腎毒性，其機制可能與紊亂ABC 轉運蛋白、氨基酸代謝、嘌呤和嘧啶代謝等有關。