化痰祛瘀法調控miR－17－5p防治動脈粥樣硬化的作用機制研究

王付啟，李文濤，王媛，秦合偉*

（1.駐馬店市中醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2.河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎，目前，西醫(yī)藥治療AS 的療效不甚理想［1］，中醫(yī)藥防治AS 取得了一定的成果，但作用機制尚不明確。新近發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA，miRNA）在AS 形成中具有重要的作用，miR－17－5p能夠通過抑制血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）和極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）的表達，影響前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtillisin/kexin type 9，PCSK9）參與負調控VLDLR 的表達，緩解內膜增生、管腔狹窄，影響AS 的發(fā)生發(fā)展［2］。因此筆者推測中醫(yī)藥防治AS 的作用機制可能與調控miR－17－5p、靶向調控VLDLR 或靶向調控PCSK9 間接調控VLDLR 有關。鑒于前期化痰祛瘀法抗AS 的研究基礎［3］，本研究旨在進一步觀察化痰祛瘀法抗AS 的作用機制是否與靶向調控miR－17－5p、靶向調控VLDLR或靶向調控PCSK9 間接調控VLDLR，抑制血管炎性反應有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ApoE-/-小鼠60只，SPF級，8周齡，體質量（20±2）g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016－0006；C57BL/6 小鼠15 只，體質量（20±2）g，雄性，購自南京大學－南京生物研究所，動物許可證號：SCXK（蘇）2015－0001；SD 大鼠60只，體質量（300±20）g，雄性，購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場，動物許可證號：SCXK（豫）2019－0002。所有動物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院動物實驗中心，試驗單位使用動物許可證號：SCXK（豫）2016－0009；飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±1）℃，濕度為60%～75%，12 h循環(huán)照明，動物自由攝食、飲水。人血管平滑肌細胞（VSMC）購自上海滬震生物科技有限公司。

本實驗設計方案經(jīng)河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核通過，符合安全性和公平性原則，實驗動物符合國家對醫(yī)學實驗動物的有關要求［4］，倫理審核批準標號：20190622。

1.2 藥物與試劑

本研究所用化痰祛瘀法藥物為血管軟化丸（組方：黃芪30 g，山楂20 g，萊菔子15 g，丹參、三七、陳皮各12 g，清半夏10 g，甘草6 g）。按照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算低、高2 個劑量分別為21.6、86.4 g/kg，分別相當于60 kg 成人臨床用量等效劑量的5.8、23.3 倍，醫(yī)院煎藥房按照要求制備生藥含量分別為0.864、3.456 g/mL的水煎液。

PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，批號：A8203－6）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司，批號：P0029）；VLDLR 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab203271）；PCSK9 抗體（Bioss 公司，批號：bs－6060R）；脂質體2000 轉染試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號：1734976）；微小RNA－17－5p 抑制物（廣州銳博生物科技有限公司合成）；其他化學試劑均由河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院實驗中心提供。

1.3 動物造模與分組給藥

所有小鼠適應性飼養(yǎng)1 周。C57BL/6 小鼠給予全程普通飼料喂養(yǎng)，作為對照組；ApoE?/?小鼠隨機分為模型組、miR-17-5p inhibitor 組、化痰祛瘀法高劑量組（高劑量組）和化痰祛瘀法低劑量組（低劑量組）4 組，每組15 只，全程均給予高脂飼料（含脂肪21%、膽固醇0.15%）喂養(yǎng)。飼養(yǎng)8 周后每組隨機抽取1 只小鼠，檢視其主動脈壁可見明顯的斑塊形成則視為造模成功，造模成功后開始進行干預，連續(xù)干預8 周后取材進行檢測。

對照組C57BL/6 小鼠給予尾靜脈注射生理鹽水處理；模型組ApoE-/-小鼠給予尾靜脈注射生理鹽水處理；miR－17－5p inhibitor組ApoE-/-小鼠給予尾靜脈注射miR－17－5p 抑制劑，劑量為30 mg/（kg·d），每周1 次；高劑量組ApoE-/-小鼠采用中藥灌胃，劑量為86.4 g/（kg·d），每日1 次；低劑量組ApoE-/-小鼠采用中藥灌胃，劑量為21.6 g/（kg·d），每日1次。

1.4 標本采集和病理形態(tài)學觀察

藥物干預8 周后，頸椎脫臼法處死小鼠，沿主動脈瓣至髂動脈分支處剝離全長主動脈。選取近主動脈瓣附近主動脈壁，一部分固定于4%甲醛溶液中，用于HE 染色；一部分置于?80 ℃冰箱凍存，用于分子生物學等檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 ELISA 法測定外周血清中IL－6、IL－10 和TNF－α等炎癥因子水平

采集小鼠血漿，嚴格按照ELISA 試劑盒說明的操作方法檢測血清中TNF－α、IL－6 和IL－10水平。

1.5.2 RT－PCR 法檢測主動脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9基因表達水平

將小鼠主動脈組織稱取質量后，加入適量的Trizol，提取總RNA。逆轉錄，采用SYBR Green 進行qRTPCR 反應。反應參數(shù)：95 ℃30 s，1 個循環(huán)；95 ℃5 s，55 ℃10 s，40個循環(huán)［4］。樣本中目的基因的計算方法為2－ΔΔCT，GAPDH為內參。引物序列：miR－17－5p正向引物為5′－CCAGCCAAAGTGCTTACAGTGC－3′，反向引物為5′－GTGCAGGGTCCGAGGTATTC－3′；VLDLR正向引物為5′－CCCGTTCTACTCAGTGTATCCC－3′，反向引物為5′－CTGCCATCGTCACAGTCATCC－3′；PCSK9正向引物為5′－GCGTCGTGGTGATTGGATTG－3′，反向引物為5′－CAGGGGTGTTGTGGATGCT－3′；GAPDH正向引物為5′－AGTGTGACGATTAATCGCAAG－3′，反向引物為5′－ATCCACATCTCTCGTTGTGGC－3′。

1.5.3 Western Blot 法檢測細胞中VLDLR 和PCSK9蛋白的表達

將主動脈稱量后，提取蛋白，采用BCA 蛋白定量法，蛋白電泳，分離，轉膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應的一抗（VLDLR 和PCSK9）分別按照1∶200和1∶500孵育，4 ℃過夜，洗滌后標記二抗（滴度1∶200）雜交。采用化學發(fā)光試劑盒檢測，使用Image Lab 4.1圖像分析軟件檢測VLDLR 和PCSK9 印跡條帶凈吸光度值，以β－actin 為內參照，結果以樣本灰度值/內參照灰度值表示［4］。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，結果用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD法檢驗，方差不齊時采用Tamhanés 法檢驗，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

動物造模鑒定時每組各處死1 只，飼養(yǎng)和給藥過程中各組小鼠因發(fā)生撕咬致死5 只，因灌胃致死2 只，由于個別數(shù)據(jù)明顯偏離樣本主體，采用偏度-峰度檢驗法判斷離群值后剔除3 只，各組小鼠進入統(tǒng)計的數(shù)量均為10只。

2.2 各組小鼠主動脈病理形態(tài)觀察

經(jīng)HE 染色后，光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠主動脈管徑厚薄不均勻，內膜不光滑，管腔內可見明顯的條狀或片狀動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊內可見淺染無定形物和鈣化顆粒物，部分動脈粥樣硬化斑塊截面積大于主動脈截面積。miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠主動脈管徑厚薄雖然不均勻，但主動脈各層結構清晰，血管細胞排列較整齊，AS 病變程度明顯輕于模型組。結果見圖1。

圖1 各組小鼠主動脈病理形態(tài)影響觀察（HE染色，×200）

2.3 各組小鼠外周血IL－6、IL－10 和TNF－α 水平比較

與對照組相比，模型組小鼠外周血清IL－6、IL－10 和TNF－α 水平均明顯較高，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）；與模型組相比，miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠外周血清中IL－6、IL－10和TNF－α 水平均明顯降低（P< 0.05），高劑量組、低劑量組小鼠之間各項血清指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。這表明miR－17－5p 與TNF－α、IL－6、IL－10 水平呈正相關，化痰祛瘀法能夠通過調控miR－17－5p 影響外周血清中IL－6、IL－10 和TNFα等血管炎癥因子水平。結果見表1。

表1 各組小鼠外周血IL－6、IL－10和TNF－α水平比較（±s，n=10，pg/mL）

表1 各組小鼠外周血IL－6、IL－10和TNF－α水平比較（±s，n=10，pg/mL）

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組TNF－α 10.14±1.84 33.47±4.61△18.19±7.15*19.26±2.59*19.89±1.78*IL－6 20.14±4.53 65.47±9.36△48.47±6.32*51.26±12.27*52.89±7.15*IL－10 165.50±28.24 392.14±31.21△191.25±26.15*231.98±34.67*235.01±36.83*

2.4 各組小鼠主動脈miR－17－5p、VLDLR 和PCSK9 mRNA表達水平比較

與對照組相比，模型組小鼠主動脈miR－17－5p和VLDLR mRNA 表達水平均明顯較高（P< 0.05），PCSK9 mRNA 表達水平明顯較低（P<0.05）。與模型組相比，miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠主動脈miR－17－5p 和VLDLR mRNA 表達均明顯下調（P< 0.05），PCSK9 mRNA 表達水平明顯上調（P< 0.05）；高劑量組、低劑量組小鼠之間miR－17－5p、VLDLR 和PCSK9 mRNA 表達比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠主動脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9 mRNA表達水平比較（±s，n=10）

表2 各組小鼠主動脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9 mRNA表達水平比較（±s，n=10）

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組PCSK9 1.57±0.21 0.27±0.06△1.36±0.32*0.84±0.19*0.83±0.15*miR－17－5p 1.05±0.11 2.05±0.16△0.86±0.19*1.48±0.54*1.50±0.61*VLDLR 1.12±0.19 2.14±0.28△0.94±0.33*1.54±0.24*1.61±0.28*

2.5 各組小鼠主動脈VLDLR 和PCSK9的蛋白表達水平比較

與對照組相比，模型組小鼠主動脈VLDLR 蛋白表達明顯升高（P< 0.05），小鼠主動脈PCSK9 蛋白表達水平明顯降低（P< 0.05）。與模型組相比，miR－17－5p inhibitor 組、高劑量組、低劑量組小鼠主動脈VLDLR 蛋白表達均明顯降低（P< 0.05），主動脈PCSK9 蛋白表達水平均明顯升高（P< 0.05）；高劑量組、低劑量組小鼠之間VLDLR 和PCSK9 表達比較無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。結果見表3和圖2。

表3 各組小鼠主動脈VLDLR和PCSK9的蛋白表達水平比較（±s，n=10）

表3 各組小鼠主動脈VLDLR和PCSK9的蛋白表達水平比較（±s，n=10）

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組PCSK9 1.13±0.18 1.06±0.17△2.32±0.45*1.84±0.26*1.77±0.33*VLDLR 1.06±0.12 2.14±0.24△0.95±0.36*1.53±0.26*1.63±0.26*

圖2 各組VSMC中VLDLR和PCSK9蛋白表達情況

3 討論

miRNA 在疾病診斷和治療中發(fā)揮了重要的作用，研究者發(fā)現(xiàn)miR－17－5p 參與了AS 的發(fā)生發(fā)展過程［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白受體（LDLR）通過結合并內吞LDL 調節(jié)膽固醇代謝。VLDLR 主要分布在心肌、骨骼肌以及脂肪組織中，參與脂質代謝調節(jié)，病理條件下，能夠促進甘油三酯在細胞中的沉積，影響泡沫細胞的形成，導致AS 的發(fā)生、發(fā)展［6］。研究發(fā)現(xiàn)，在粥樣斑塊存在下，通過高表達VLDLR，結合低脂飲食，能夠降低血漿中VLDL及低密度脂蛋白（LDL）水平，促進AS斑塊消退［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9 表達于多種細胞，通過影響VLDLR 的表達［8］，可增強肝臟LDLR 的溶酶體和內涵體降解，提高血清LDL－C水平［9］。有研究者通過轉染PCSK9 進入VSMC，發(fā)現(xiàn)降低了VSMC 細胞VLDLR 水平［10］。新近研究發(fā)現(xiàn)，AS 發(fā)病與miR－17－5p 表達呈正相關，與VLDLR 的表達呈負相關；miR－17－5p 能夠通過靶向調控VLDLR，直接抑制VSMC 細胞VLDLR表達，miR－17－5p 通過影響PCSK9 參與負調控VLDLR的表達，抑制AS的發(fā)生發(fā)展［3］。

高脂血癥可歸屬于“血濁”范疇，血濁可致痰、瘀、毒等病理產(chǎn)物產(chǎn)生，壅塞脈道，沉積管壁，形成AS。本課題組結合中醫(yī)基礎理論和臨床實踐，確定痰阻血瘀是AS 的主要證型。本研究所用化痰祛瘀法的藥物為中成藥血管軟化丸，該方中山楂消食導滯，為君藥；黃芪補氣健脾，半夏健脾燥濕化痰，三七和丹參活血化瘀，共為臣藥；萊菔子下氣消食除脹，陳皮理氣和中，共為佐藥；甘草健脾和中，調和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏消積化痰、活血化瘀之功［11］。

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，化痰祛瘀法能夠降低血清炎性反應，調節(jié)血脂，抑制AS斑塊發(fā)展［12－13］。此外，化痰祛瘀法抗AS 作用機制可能與介導巨噬細胞極化效應，調控miRNA－467b 靶向LPL 調控巨噬細胞，減少炎癥因子分泌和巨噬細胞脂質蓄積有關［14－16］?；奠铕龇軌蛲ㄟ^調控miRNA－126，影響其下游GRS16、CXCL12、CXCR4、VCAM－1 等細胞炎性因子表達，參與VEC 損傷與修復，抑制AS 發(fā)生發(fā)展［3］。新近研究發(fā)現(xiàn)，化痰祛瘀法能夠通過靶向調控miR－181影響輸入蛋白α3/NF－κB 信號通路，降低炎性因子水平，減輕血管內皮損傷，抑制AS發(fā)生發(fā)展［4］。

鑒于miRNA－17－5p能夠通過抑制血管平滑肌細胞VLDLR表達，影響AS的發(fā)生發(fā)展［2］，本研究旨在通過化痰祛瘀法抗AS 的作用機制是否與靶向調控miR－17－5p，靶向調控VLDLR 或靶向調控PCSK9間接調控VLDLR，抑制血管炎性反應，進而揭示化痰祛瘀法防治AS的分子機制。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過化痰祛瘀法干預后，miR－17－5p inhibitor 組、高劑量組、低劑量組小鼠外周血清中IL－6、IL－10 和TNF－α 水平明顯下調，主動脈中miR－17－5p 和VLDLR mRNA 表達水平均明顯降低，PCSK9 mRNA 表達水平明顯升高?；奠铕龇ú煌瑒┝拷M之間各項指標比較差異不明顯，不存在量效差異。病理學檢測也證實，化痰祛瘀法和miR－17－5p inhibitor 均能夠抑制AS 的發(fā)生發(fā)展。可見，化痰祛瘀法抗AS 的作用機制可能與靶向調控microRNA－17－5p，靶向調控VLDLR 或靶向調控PCSK9 間接調控VLDLR，抑制血管炎性反應，減輕血管內皮細胞損傷有關。