不同炮制山茱萸入方的六味地黃湯對去卵巢大鼠股骨OPG/RANK/RANKL基因表達的干預作用及機理

雷欣東，楊磊，朱付平，易建，于慧，龍瓊，李俊威，黃莉，肖望重，戴冰*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）是女性絕經(jīng)期后由于卵巢功能降低、雌激素分泌水平下降所引起的骨質(zhì)疏松癥［1］。主要表現(xiàn)為單位體積內(nèi)骨量減少、骨組織顯微結構退化、骨密度下降及骨強度減弱，導致骨脆性增高，骨折危險性增加。其發(fā)病機制與雌激素水平降低導致的骨代謝失衡，即成骨細胞的骨形成能力與破骨細胞的骨吸收能力失衡有關［2］。研究發(fā)現(xiàn)，護骨素（Osteoprotegerin recombinant protein，OPG）/NF－κB 受體活化因子（Receptor Activator for Nuclear Factor－κB，RANK）/NF－κB 受體活化因子配體（Receptor Activator for Nuclear Factor－κB Ligand，RANKL）系統(tǒng)在調(diào)節(jié)骨代謝中起關鍵作用［3］。探討該系統(tǒng)與PMOP 發(fā)病的關系是近年來PMOP 研究的熱點問題。

目前對該病的治療主要以雌激素、鈣劑和雙膦酸鹽類藥物，如阿侖膦酸鈉等為主，雖有較好的臨床療效，但由于其副作用較大，在一定程度上限制了推廣與長期應用。因此，療效確切、不良反應少的中藥越來越受到臨床使用的重視。中醫(yī)學認為，腎藏精，為先天之本，主骨生髓。因此，以“骨痛、骨痿不用”為主要表現(xiàn)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，多用補腎法主治之。

六味地黃丸是宋·錢乙《小兒藥證直訣》中記載的補腎方劑，全方以熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓六藥為末，煉蜜丸制成。由于其組方嚴謹，臨床療效確切，成為治療以腰膝酸軟、頭暈耳鳴等為主要表現(xiàn)的腎陰虛證的經(jīng)典方劑，也是臨床用治PMOP 的常用方劑。大量實驗、臨床研究均證實該方對PMOP 具有較好療效，然其作用機制具體為何，目前尚未能完全闡釋清楚。因此，需要開展相關研究探討六味地黃湯改善PMOP的具體機制。

本課題組前期采用不同炮制山茱萸配伍入方制成六味地黃湯，比較研究了不同炮制山茱萸入藥的六味地黃湯（不同組六味地黃湯）對去卵巢模型大鼠的作用差異，并從骨代謝指標的層面探討了其作用機理［4］。發(fā)現(xiàn)不同組六味地黃湯均可通過調(diào)節(jié)反映成骨細胞與破骨細胞活性的骨代謝指標，提高模型大鼠骨密度水平，從而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。這是否與六味地黃湯可通過調(diào)控模型大鼠OPG/RANK/RANKL 系統(tǒng)有關？若有關，不同炮制山茱萸入方的六味地黃湯對該系統(tǒng)的調(diào)控能力是否有差異？為解決上述問題，本研究擬在前研究的基礎上，采用RT－qPCR 技術，探討不同組六味地黃湯對模型大鼠股骨OPG、RANK、RANKL mRNA 表達水平的影響，進一步探究不同組六味地黃湯干預絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用差異及其機理，為臨床選擇更優(yōu)的炮制品山茱萸配伍入六味地黃方提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雌性6月齡SD大鼠70只，許可證號：SYXK（湘）2015－0003，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。動物實驗嚴格遵守湖南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會指導原則。于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：室溫20～22 ℃，濕度50%～55%。

1.2 主要藥物與湯劑制備

阿侖膦酸鈉片（Alendronate Sodium Tablet，批號：1704004，云南萬裕藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg）；六味地黃湯按原方比例（熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）稱取各味藥材飲片，方中除山茱萸外，飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科；不同炮制山茱萸以前期研究發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)炮制工藝制成［4］：生品山茱萸（生茱萸）、酒制山茱萸（酒茱萸）、蒸制山茱萸（蒸茱萸）、鹽制山茱萸（鹽茱萸）。

六味地黃湯煎煮方法為：原藥材加6 倍量水，煎煮2 次，過濾，合并2 次藥液后濃縮至1.5 g/mL。再按比例分別稱取不同炮制品山茱萸配伍入方，操作同上，均制得生藥含量為1.5 g/mL 的濃縮液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

雌二醇放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術研究所有限公司，批號：180820）；RT－qPCR 用試劑盒：總RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，批號：DP419，規(guī)格：50 次］；NovoScript Plus All－inone 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix（Gdna Purge）（批號：0516971，規(guī)格：50 次）；NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus（批號：0514771，規(guī)格：50次）。

1.4 主要儀器

DAD 經(jīng)濟節(jié)能型蒸柜；超高速冷凍離心機（德國HERMLE Labor－technik GmbH，型號：Z36HK，離心半徑17.5 cm）。

1.5 分組

將所有大鼠隨機分為7組：空白組、模型組、阿侖膦酸鈉對照組（陽性藥物組），以及不同炮制山茱萸分別配伍入方的六味地黃湯生茱萸組（生茱萸組）、六味地黃湯酒茱萸組（酒茱萸組）、六味地黃湯鹽茱萸組（鹽茱萸組）和六味地黃湯蒸茱萸組（蒸茱萸組），每組10只。

1.6 造模

除空白組外，所有雌性SD 大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛溶液（給藥劑量3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉。于腹部正中偏下處備皮，碘伏消毒，從腹正中線做一處縱行切口，打開腹壁，在腹腔脂肪中順著輸卵管分離出菜花樣卵巢組織，結扎后剪去雙側卵巢，逐層縫合切口，生理鹽水洗凈血跡。術后大鼠均肌肉注射20萬U青霉素預防感染。

1.7 給藥與取材

術后第5 天開始對大鼠進行灌胃給藥，其中空白組、模型組大鼠以10 mL/kg劑量給予0.9%生理鹽水灌胃，酒茱萸組、鹽茱萸組、蒸茱萸組和生茱萸組以6.75 g/kg 劑量給予相應六味地黃湯灌胃，陽性藥物組以6.3 mg/kg劑量給予阿侖膦酸鈉灌胃，每日1次，連續(xù)14周。給藥后每周測量1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整藥量。

給藥第14 周末，所有大鼠禁食24 h 后麻醉，先行腹主動脈采血，再取大鼠兩側股骨。所得血液靜置后以3 500 r/min 離心15 min，取血清置于－20 ℃冰箱保存。股骨剝離肌肉組織后，用濕紗布包裹，置于凍存管中。每組取2 只大鼠左側股骨頭，用4%多聚甲醛固定，其余股骨于－80 ℃冰箱保存以備后用。

1.8 檢測指標

1.8.1 血清雌二醇（E2）水平

由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院同位素室采用放免法檢測。

1.8.2 股骨頭組織病理學觀察

取出左側股骨頭，4%多聚甲醛固定72 h 后，再用10%EDTA 脫鈣液脫鈣，脫鈣液每3 d 換1 次。脫鈣完成后，用PBS沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，次日進行石蠟包埋，切片厚度為2～4 μm，常規(guī)HE 染色。光鏡下觀察大鼠股骨頭組織病理學改變。

1.8.3 股骨中OPG、RANK、RANKL 的mRNA 表達水平測定

于－80 ℃冰箱取出凍存的股骨，液氮下研磨成粉，按Trizol 試劑盒說明提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，以β－actin 作為內(nèi)參照。各基因引物序列由北京擎科生物科技有限公司設計合成，序列見表1。RT－qPCR擴增體系為20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Hot Star Taq Master Mix（2×）10 μL，加RNase－free dd H2O至20 μL。擴增程序為：預變性94 ℃5 min；變性94 ℃45 s，退火60 ℃45 s，延伸72 ℃1 min，共40 個循環(huán)，后于72 ℃延伸10 min。擴增反應在ABI7500實時熒光PCR 系統(tǒng)上執(zhí)行。運用2－ΔΔCt方法，比較各組OPG、RANK、RANKL的mRNA水平相對表達量。

表1 各基因引物序列

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD 法，若不滿足正態(tài)性，則用非參數(shù)檢驗，P< 0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

大鼠喂養(yǎng)過程中，部分組出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，去除離群值后，每組計入統(tǒng)計數(shù)量的大鼠均為7只。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量情況

與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量有統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示在連續(xù)喂養(yǎng)14周后，去卵巢大鼠體質(zhì)量上升明顯。與模型組比較，酒茱萸組、生茱萸組、鹽茱萸組、蒸茱萸組大鼠體質(zhì)量均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示不同山茱萸入方的六味地黃湯均可以抑制去卵巢后引起的體質(zhì)量迅速增長，且其效果優(yōu)于陽性藥物組。見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量情況比較（±s，n=7）

表2 各組大鼠體質(zhì)量情況比較（±s，n=7）

注：與空白組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

組別空白組模型組酒茱萸組鹽茱萸組蒸茱萸組生茱萸組陽性藥物組組別空白組模型組酒茱萸組鹽茱萸組蒸茱萸組生茱萸組陽性藥物組第7周358.07±23.39 387.50±29.46 363.31±23.40 360.62±51.26 362.29±40.00 378.57±39.52 395.83±37.66第14周374.40±21.22 431.43±58.81△△381.60±37.47*386.96±37.49*386.14±34.11*387.08±21.29*400.21±47.62第1周333.22±27.02 333.18±29.46 361.37±18.70 352.18±19.78 334.30±27.01 360.37±18.70 348.66±30.39第8周366.83±20.04 385.14±53.74 366.94±26.42 364.24±45.32 354.80±33.63 375.22±38.61 396.76±40.36第2周350.83±20.67 364.40±36.33 358.47±21.35 358.68±28.93 352.81±33.30 362.05±24.66 366.49±23.09第9周381.33±20.53 392.76±62.47 376.07±31.30 385.18±36.91 364.87±33.21 383.92±41.85 406.86±39.30第3周355.18±22.40 363.18±37.07 370.19±29.70 364.08±46.99 358.57±38.09 363.77±30.52 363.44±28.02第10周373.98±22.88 395.95±62.23 378.83±26.76 381.04±37.06 366.40±31.80 381.77±41.11 392.77±37.63第4周350.05±21.96 369.33±37.84 362.69±29.92 354.44±46.20 373.77±43.87 362.68±38.65 373.01±29.53第11周359.97±22.79 399.20±61.77 375.71±36.15 376.68±37.47 363.57±30.35 384.23±36.04 400.69±35.69第5周342.65±38.74 367.64±40.86 367.31±33.70 344.26±54.47 351.19±43.88 370.55±41.85 382.27±33.57第12周363.78±24.66 410.54±60.99△377.66±38.61 376.98±40.48 375.86±33.08 387.07±27.28 400.31±39.50第6周336.87±55.96 376.20±43.84 364.96±25.90 357.00±51.07 351.24±37.55 373.92±36.31 393.89±34.38第13周365.88±30.88 425.93±56.45△367.84±36.81 384.22±42.82 379.71±33.06 391.88±24.05 394.87±43.60

2.3 各組大鼠股骨頭組織形態(tài)學情況

與空白組比較，模型組骨小梁變薄，出現(xiàn)斷裂，骨板走形凌亂；骨髓腔出現(xiàn)大量空泡，提示脂肪組織增多，紅骨髓變?yōu)辄S骨髓，造血功能下降。與模型組比較，酒茱萸組、蒸茱萸組骨小梁增厚增粗，斷裂處明顯減少；骨髓腔脂肪空泡明顯減少，骨髓含量增加；骨小梁骨板走形較為均勻。而鹽茱萸組、生茱萸組骨小梁斷裂的情況雖得到一定的改善，但脂肪空泡并未明顯改善，效果較酒茱萸組、蒸茱萸組差。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨頭組織形態(tài)學情況（HE染色，×200）

2.4 各組大鼠血清E2水平比較

與空白組比較，模型組大鼠血清E2水平有統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示大鼠去卵巢后，血清E2水平會顯著降低。與模型組比較，酒茱萸組、生茱萸組、蒸茱萸組模型大鼠血清E2水平均有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），提示酒茱萸、生茱萸、蒸茱萸入藥的六味地黃湯均可顯著改善去卵巢導致的大鼠血清雌二醇降低。見表3。

表3 各組大鼠血清E2水平比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清E2水平比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，△P < 0.05；與模型組比較，*P < 0.05，**P <0.01。

組別空白組模型組生茱萸組酒茱萸組鹽茱萸組蒸茱萸組陽性藥物組n7 7 7 7 7 7 7 E2 7.78±2.61 3.02±1.67△5.90±2.38*6.53±1.73**5.12±1.81 5.90±1.44*5.80±1.22*

2.5 各組大鼠股骨OPG、RANK、RANKL mRNA 表達水平比較

與空白組比較，模型組大鼠股骨OPG、RANKL 的mRNA 表達具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05，P< 0.01），提示去卵巢后，大鼠股骨OPG mRNA 表達明顯下降，RANKL mRNA 明顯上升，而不同組六味地黃湯均可顯著降低RANKL mRNA 表達（P< 0.01）。不同組六味地黃湯雖均可提高模型大鼠股骨OPG mRNA 表達，但組間比較并無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 各組大鼠股骨OPG、RANK、RANKL的mRNA表達水平比較（±s）

表4 各組大鼠股骨OPG、RANK、RANKL的mRNA表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，△P < 0.05，△△P < 0.01；與模型組比較，**P <0.01。

RANKL 1 3.12±1.65△△0.59±0.62**0.81±0.24**0.89±0.23**1.24±0.68**0.83±0.65**組別空白組模型組酒茱萸組鹽茱萸組蒸茱萸組生茱萸組陽性藥物組n7 7 7 7 7 7 7 OPG 1 0.24±0.33△0.77±0.74 0.71±0.45 0.96±0.86 0.93±0.93 0.75±0.27 RANK 1 0.91±0.54 0.34±0.27△1.13±0.94 0.95±0.32 0.49±0.50 0.62±0.34

3 討論

卵巢是雌激素分泌的主要來源場所，本研究顯示模型組大鼠在切除雙側卵巢后，血清雌激素水平顯著降低，股骨頭病理切片顯示骨小梁斷裂明顯，出現(xiàn)大量脂肪空泡，表明造模較好地達到了預期效果，去卵巢絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型建立成功。

本實驗發(fā)現(xiàn)，酒茱萸組、蒸茱萸組、生茱萸組均可以顯著提高模型大鼠血清E2水平，而鹽茱萸組的效果偏弱。這可能與六味地黃湯的補腎作用有關，中醫(yī)學中“腎”作為五臟之一，其實質(zhì)是涵蓋生殖、神經(jīng)、內(nèi)分泌等多方面的綜合系統(tǒng)。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，腎虛證的調(diào)控位置可能在下丘腦，經(jīng)過下丘腦－垂體－靶腺軸影響人體的生命活力［5］，而絕經(jīng)后婦女卵巢幾乎不產(chǎn)生性激素，此時體內(nèi)的雌激素主要是由腎上腺所分泌合成的脫氫表雄酮（DHEA）在外周組織如骨、脂肪、肝臟等處，由特定的酶催化轉化而來［6］。大量實驗研究與臨床研究均證實六味地黃湯具有調(diào)控雌激素及其受體的藥理作用［7］，因此，筆者推測六味地黃湯調(diào)節(jié)模型大鼠血清雌激素水平的機制或與其可通過調(diào)控下丘腦－垂體－腎上腺軸，影響去卵巢后的大鼠雌激素轉化速率有關，然該推測的證明還需進一步研究實現(xiàn)。另一方面，從股骨頭病理切片看，不同組六味地黃湯均可以改善骨小梁斷裂，減少脂肪空泡。但酒茱萸組、蒸茱萸組效果優(yōu)于鹽茱萸組與生茱萸組。

山茱萸鹽制可促進藥物入腎經(jīng)，然而在本實驗中發(fā)現(xiàn)，鹽茱萸入方的六味地黃湯對血清E2的改善作用較差，筆者認為這可能與多種原因有關。一方面，有研究表明山茱萸酒制和蒸制可使其多糖成分明顯增加，鹽制則不利于多糖的浸出［8］。而山茱萸多糖有一定的抗衰老與生殖保護作用，可以顯著提升衰老雌性大鼠雌激素水平［9］。因此，鹽茱萸多糖成分較其他制品山茱萸低或許是該情況出現(xiàn)的原因之一。另一方面，也不排除山茱萸鹽制工藝區(qū)別、實驗操作技術失誤等多方面因素從而導致結果出現(xiàn)偏差。

肥胖也是影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的因素之一，隨著脂肪含量增加，肌肉含量與骨礦鹽含量減少，導致骨密度減少［10－11］。本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠在去卵巢后，雌激素水平下降，骨質(zhì)發(fā)生流失，同時體質(zhì)量也持續(xù)性增加，在連續(xù)喂養(yǎng)14 周后，與空白組大鼠比較，體質(zhì)量有顯著性差異，符合肥胖與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關聯(lián)性，其機理可能與六味地黃湯可提高模型大鼠血清雌激素水平，糾正去卵巢后的脂代謝紊亂，抑制去卵巢后持續(xù)體質(zhì)量增長導致的肥胖，增加肌肉與骨礦鹽含量，提高骨密度，從而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有關。酒茱萸組、蒸茱萸組、鹽茱萸組和生茱萸組均可以顯著抑制大鼠去卵巢后的體質(zhì)量增長，且組間差距并不明顯。

一般情況下，骨刺激因子會先與成骨細胞發(fā)生信息傳遞，使其分泌包括RANKL 在內(nèi)的一系列細胞因子［12］。RANKL 與破骨細胞表面受體RANK 結合后，可促進破骨細胞分化成熟，加速骨吸收［13］。而OPG 是RANKL 的誘餌樣受體，可競爭性結合RANKL，阻斷RANKL 與RANK 的相互作用，抑制破骨細胞分化成熟，從而調(diào)節(jié)骨代謝。女性絕經(jīng)后雌激素水平降低，OPG 分泌減少，RANKL 水平上升，破骨細胞活性增加。骨吸收加速，導致骨質(zhì)流失，引發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松［14］。本研究顯示，不同組六味地黃湯均可提高模型大鼠股骨OPG mRNA 表達，降低RANKL mRNA 表達，使OPG/RANKL 比值上升，RANKL 與RANK 的結合減少，從而抑制破骨細胞的分化與成熟，使骨吸收水平下降，改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，這可能是六味地黃湯改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重要機制之一。其中，不同組六味地黃湯提高OPG mRNA 表達的效果相似，沒有顯著性差異，而生茱萸組抑制RANKL mRNA 表達的效果稍弱于酒茱萸組、鹽茱萸組、蒸茱萸組。這表明酒制、鹽制、清蒸制、生品山茱萸入藥的六味地黃湯均可以通過調(diào)控股骨OPG、RANK、RANKL mRNA 表達，抑制過度激活的破骨細胞活性，修復斷裂的骨小梁，提高骨密度水平，從而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，且不同組六味地黃湯的效果沒有統(tǒng)計學意義，但酒制品、清蒸制品山茱萸入藥的六味地黃湯效果更佳，臨床可以根據(jù)具體情況，酌情選擇合適的炮制品山茱萸入方。這一研究可為2020 版《中華人民共和國藥典》規(guī)定六味地黃丸中采用酒茱萸入方提供實驗數(shù)據(jù)支持。