“增己降乳”組合菌制劑在濃香型白酒中的應(yīng)用研究

何宏魁，曹潤(rùn)潔，周慶伍，李安軍，湯有宏，張光耀

（1.安徽瑞思威爾科技有限公司，安徽亳州 236820；2.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽亳州 236820；3.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州 236820）

窖泥是中國(guó)所有涉及到使用窖池固態(tài)發(fā)酵的白酒釀造的基礎(chǔ)，是一個(gè)擴(kuò)大化了的適合白酒發(fā)酵功能菌代謝、生長(zhǎng)繁殖的廣義培養(yǎng)基。白酒界素有“千年窖池萬(wàn)年糟，酒好全憑窖池老”的說(shuō)法，其根本原因在于窖池中窖泥的微生物活性及其群落組成結(jié)構(gòu)的差異性[1]，窖泥微生物的重要作用不言而喻。己酸乙酯[2-3]是中國(guó)各大香型白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)之一，更是濃香型白酒的主體香味成分，對(duì)白酒酒體的風(fēng)格有著重要的作用，己酸是合成己酸乙酯的重要前體物質(zhì)[4]，己酸菌是一類能夠產(chǎn)生己酸的菌，多數(shù)以梭菌屬為主[5]。窖泥中己酸菌活菌數(shù)的測(cè)定一直是白酒生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)酵容器窖池中窖泥的重要理化指標(biāo)之一，多被認(rèn)為是發(fā)酵過(guò)程最終形成的白酒產(chǎn)質(zhì)量的一項(xiàng)重要影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

老窖池新鮮窖泥、新鮮酒醅。

1.1.2 營(yíng)養(yǎng)液的配制

取新鮮的窖泥和新鮮的酒醅按照1∶1 溶于1000 mL ddH2O，使用粉碎機(jī)打碎，12000 r/min 離心10 min，收集上清液，即為營(yíng)養(yǎng)液。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

瘤胃球菌屬培養(yǎng)基：CuCl2·2H2O、AlCl3、Na2MoO4·2H2O 分別稱取0.1 g，制成10 mL 溶液，標(biāo)記為0.01 g/ mL；Pyridoxine 吡哆醇/維生素B6、Biotin 生物素、p-aminobenzoic acid 對(duì)氨基苯甲酸、lipoic acid 硫辛酸、Riboflavin 核黃素/維生素B2、維生素B12、葉酸分別稱取0.1 g，制成10 mL 溶液，并將上述配制完成的溶液置于4 ℃保存。

Clostridium 梭菌屬培養(yǎng)基：酵母提取物0.6 g，蛋白胨2 g，葡糖糖1 g，氯化鈉1 g，牛肉膏2 g，可溶性淀粉0.2 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.1 g，乙酸鈉0.6 g。制成200 mL 溶液，并將上述配制完成的溶液置于4 ℃保存。

1.1.4 儀器設(shè)備

安捷倫GC7890氣相色譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混菌制劑的制備

分別將各個(gè)梯度菌懸液鋪在上述步驟中的培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)3～5 d，得到的優(yōu)勢(shì)菌菌落作為混菌制劑種子分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后按照一定比例進(jìn)行菌苔混合制作混菌制劑。

1.2.2 混菌制劑混合菌液實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

在500 mL 的營(yíng)養(yǎng)液中，添加酵母提取物1.5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖2.5 g，氯化鈉3.0 g，牛肉膏2.5 g，可溶性淀粉1.0 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.25 g，乙酸鈉1.5 g，刃天青鈉鹽2.0 g。把純培養(yǎng)備份的優(yōu)勢(shì)厭氧菌（菌落大小直徑為2.5～3 mm）按照一定的菌落個(gè)數(shù)比例混合在一起制成混合菌液，對(duì)照組則不加混合菌，最終pH 值調(diào)至7.0，滅菌除氧，厭氧罐中培養(yǎng)7 d。

1.2.3 混菌制劑應(yīng)用前后發(fā)酵出池酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)解析

選取3 個(gè)車間9 個(gè)窖池用于測(cè)試，其中老窖池（約50 年窖齡）（A01），兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組窖池（A0102、A0104）、不加混菌制劑的對(duì)照組（A0106）；新窖池（3-5 年窖齡）（C02、C05），其中一個(gè)車間兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組窖池（C0201、C0203）、不加混菌制劑的對(duì)照組（C0209），另一車間兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組窖池（C0512、C0514）、不加混菌制劑的對(duì)照組（C0510）?；炀苿┩斗徘叭∶總€(gè)窖池池底窖泥及底層酒醅，混菌制劑投放窖池底部經(jīng)一個(gè)輪次的發(fā)酵后再次取相應(yīng)窖池的池底窖泥及酒醅作為高通量測(cè)序的樣品，高通量測(cè)序方法采用細(xì)菌16S（V3—V4 區(qū)）擴(kuò)增子測(cè)序[6]，擴(kuò)增引物[7-8]（GTACTCCTACGGGAGGCAGCA、GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT），樣品由北京奧維森生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 酒樣色譜分析方法

氣相色譜檢測(cè)[9]在安捷倫GC7890 氣相色譜儀上進(jìn)行。

上樣柱載氣是氮?dú)?，純度?9.999%，流速為1.0 mL/min，在25 ℃下檢測(cè)其壓力值為15p.s.i.（磅/平方英寸）。用于樣品分析的色譜柱為：CP-WAX 50 CB(50 m×0.25 mm×0.2 μm）毛細(xì)管柱。進(jìn)樣量為1μL，進(jìn)樣口溫度：230 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比60∶1。

色譜柱溫度變化為：35 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min程序升溫至100 ℃，不保持，再以10 ℃/min升溫至195 ℃，保持18 min。注射器和檢測(cè)器的溫度為210～240 ℃[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌種篩選及鑒定

提取各個(gè)菌落的基因組，擴(kuò)增16S 全長(zhǎng)rDNA并測(cè)序通過(guò)NCBI 比對(duì)，得到優(yōu)勢(shì)菌株鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，在本研究中的厭氧培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)的厭氧菌落主要包括Clostridium tyrobutyricum酪丁酸梭菌、Ruminococcaceae bacteriumCPB6反芻球菌細(xì)菌CPB6、Lactobacillus acidipiscis乳酸桿菌、Lactobacillussp.乳桿菌（本研究中編號(hào)為GJG1）、Lachno-spiraceae bacteriumBTY6 木犀科細(xì)菌BTY6、Clostridium beijerinckii拜氏梭菌（本研究中編號(hào)為GJG2）等優(yōu)勢(shì)菌種。這些經(jīng)過(guò)分子鑒定的優(yōu)勢(shì)厭氧菌都可以進(jìn)一步純培養(yǎng)并通過(guò)菌苔生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大培養(yǎng)。

表1 本研究中所鑒定的菌種

2.2 混菌制劑在窖池中的初步應(yīng)用

將反芻球菌細(xì)菌CPB6、酪丁酸梭菌、乳桿菌GJG1、乳酸桿菌、木犀科細(xì)菌BTY6 以及拜氏梭菌GJG2 按照一定的菌落個(gè)數(shù)比例混合于培養(yǎng)基中獲得混菌懸液。將所得混菌懸液鋪板培養(yǎng)獲得混菌菌苔（厭氧培養(yǎng)的溫度37 ℃時(shí)間96 h），取池底新鮮窖泥，將混菌制劑與之混合均勻，采用一定的方式制作成混菌制劑，將制作好的混菌制劑均勻投放在窖池底部，入池完畢后封窖隨窖池進(jìn)行發(fā)酵。

2.3 混菌制劑實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵情況

混合菌液發(fā)酵實(shí)驗(yàn)產(chǎn)酸結(jié)果如表2所示。

表2 混合菌液發(fā)酵實(shí)驗(yàn)產(chǎn)酸情況 (mg/L)

由表2 可知，混合菌液具有顯著消耗乙酸、乳酸和產(chǎn)己酸、丁酸的能力，其中，對(duì)照組產(chǎn)乳酸是混合菌液的2 倍，對(duì)照組產(chǎn)乙酸是混合菌液的接近10倍，混合菌液產(chǎn)己酸是對(duì)照組的接近100倍。

2.4 混菌制劑應(yīng)用前后發(fā)酵出池酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

表3 是測(cè)試窖池窖泥及酒醅加混菌制劑前及發(fā)酵一輪次后樣本的OTU 數(shù)、Chao1 指數(shù)[11]。以實(shí)驗(yàn)組C0201、C0203，對(duì)照組（不添加混菌制劑）C0209 窖泥及酒醅樣本為例，其OTU 數(shù)目顯示，經(jīng)加過(guò)混菌制劑的實(shí)驗(yàn)組酒醅PC0201-1、PC0203-1和窖泥NC0201-1、NC0203-1 的OTU 數(shù)目均比對(duì)照組增幅較大，數(shù)據(jù)結(jié)果表明，混菌制劑的加入使得測(cè)試窖池微生物豐富度指數(shù)及數(shù)量得到顯著提升，其他6個(gè)窖池也表現(xiàn)出相似的規(guī)律。

表3 測(cè)試窖池窖泥及酒醅加混菌制劑前及發(fā)酵一輪次后樣本的OTU數(shù)、Chao1指數(shù)

圖1為測(cè)試窖池C02窖泥加混菌制劑前及發(fā)酵一輪次后樣本細(xì)菌屬水平分布。由圖1 可知，不加菌的對(duì)照組發(fā)酵結(jié)束后窖泥中Lactobacillus乳酸桿菌含量增幅較大，經(jīng)一輪發(fā)酵后Lactobacillus含量相對(duì)占比由6.79%升到54.74%，遠(yuǎn)高于發(fā)酵前的含量，而加菌的實(shí)驗(yàn)組的Lactobacillus乳酸桿菌含量在發(fā)酵結(jié)束后不僅沒(méi)有升高，且明顯低于發(fā)酵前，物種豐富度較之對(duì)照組高，尤其對(duì)新窖池C0201，其窖泥第一輪次發(fā)酵前Lactobacillus含量相對(duì)占比90.91%，添加混菌制劑發(fā)酵結(jié)束后相對(duì)占比2.93%。圖2的測(cè)試窖池C05窖泥加混菌制劑前及發(fā)酵一輪次后樣本細(xì)菌屬水平分布顯示實(shí)驗(yàn)組乳酸桿菌含量相對(duì)對(duì)照組降低顯著的是窖池C0514-1，由第一輪次發(fā)酵前Lactobacillus含量相對(duì)占比78.33%，添加混菌制劑發(fā)酵結(jié)束后相對(duì)占比36.66%。圖3 的測(cè)試窖池A01 車間窖泥加混菌制劑前及發(fā)酵一輪次后樣本細(xì)菌屬水平分布顯示代謝產(chǎn)物能夠形成己酸乙酯的前體物質(zhì)己酸的細(xì)菌Caproiciproducens實(shí)驗(yàn)組增加的比例最大，發(fā)酵前后Caproiciproducens含量相對(duì)平均占比由7.59%提升到24.38%。圖4、圖5 優(yōu)勢(shì)菌Ruminococcaceae、Clostridium、Syntrophomonas、Aminobacterium均有不同程度的增高，尤其對(duì)新窖池C02 車間表現(xiàn)更為顯著，其中C0201 窖池經(jīng)一輪次發(fā)酵消耗后，Ruminococcaceae 含量由發(fā)酵前的3.5%提高到12.06%，而對(duì)照組窖池C0209 經(jīng)一輪次發(fā)酵消耗后，Ruminococcaceae 含量由發(fā)酵前的50.9%降低到9.17%。

圖1 測(cè)試窖池C02窖泥加混菌制劑前及發(fā)酵一輪次后樣本細(xì)菌屬水平分布

圖2 測(cè)試窖池C05窖泥加混菌制劑前及發(fā)酵一輪次后樣本細(xì)菌屬水平分布

圖3 測(cè)試窖池A01車間窖泥加混菌制劑前及發(fā)酵一輪次后樣本細(xì)菌屬水平分布

圖4 測(cè)試窖池加菌后科水平分布含量前8的微生物

圖5 測(cè)試窖池加菌后屬水平分布含量前8的微生物

2.5 混菌制劑應(yīng)用后出池酒醅風(fēng)味物質(zhì)對(duì)比分析

由表4 可知，加混菌制劑發(fā)酵結(jié)束后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出池酒醅的風(fēng)味物質(zhì)含量中，己酸乙酯含量增加量較多，實(shí)驗(yàn)組酒醅中己酸乙酯含量提高3 倍左右，同時(shí)乳酸乙酯含量比對(duì)照組低，而對(duì)照組酒醅中發(fā)酵前后變化不大。此外，己酸含量增加量較多，在酒體風(fēng)格影響作用較大的呈香物質(zhì)的總量上，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組是顯著提升的。

表4 加混菌制劑發(fā)酵結(jié)束后出池酒醅的風(fēng)味物質(zhì)含量對(duì)比分析 (mg/L)

2.6 混菌制劑應(yīng)用后出池酒醅和窖泥理化分析

由表5可知，加混菌制劑發(fā)酵一輪后，A車間發(fā)酵后出池酒醅實(shí)驗(yàn)組淀粉含量比例8.32%，對(duì)照組10.35%，B 車間經(jīng)發(fā)酵一輪后，實(shí)驗(yàn)組淀粉含量比例比對(duì)照組含量低，表明實(shí)驗(yàn)組中淀粉被相關(guān)微生物分解得更充分，發(fā)酵更為充分，酒醅發(fā)酵程度提高。

表5 混菌制劑應(yīng)用后發(fā)酵前后出池酒醅理化指標(biāo)對(duì)比分析

由表6 可知，加混菌制劑發(fā)酵一輪后，池底窖泥的pH 值有所改善提升，兩個(gè)車間實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵結(jié)束后，己酸菌活菌數(shù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都有所增加，實(shí)驗(yàn)組的增幅比對(duì)照組的增幅更大。表明加了“混菌制劑”的實(shí)驗(yàn)組窖泥己酸菌活菌數(shù)高于對(duì)照組。

表6 加混菌制劑發(fā)酵前后窖泥理化指標(biāo)對(duì)比分析

2.7 混菌制劑應(yīng)用前后酒樣香味成分對(duì)比分析

由表7 可知，橫向?qū)Ρ?，?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（不加菌）的窖池發(fā)酵一個(gè)周期后，酒樣中四大酯（己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯）含量呈增加的趨勢(shì)，其中濃香型的主體香己酸乙酯含量實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組多，橫向?qū)Ρ龋瑢?shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表現(xiàn)出呈酸類物質(zhì)也略有升高，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組己酸含量高，乙酸、丁酸含量接近?？v向?qū)Ρ龋總€(gè)窖池加菌前后的含量比較，酯含量尤其是實(shí)驗(yàn)組己酸乙酯含量增幅相對(duì)對(duì)照組較大，乳酸乙酯增幅相對(duì)己酸乙酯的增幅小，酸類含量增幅與對(duì)照組相比差別不大。

表7 加混菌制劑測(cè)試前后基酒酒樣風(fēng)味物質(zhì)含量對(duì)比分析 (mg/L)

3 結(jié)論

混菌制劑實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)混合菌液具有顯著消耗乙酸、乳酸和產(chǎn)己酸、丁酸的能力，其中，對(duì)照組產(chǎn)乳酸是混合菌液的2 倍，對(duì)照組產(chǎn)乙酸是混合菌液的接近10 倍，混合菌液產(chǎn)己酸是對(duì)照組的接近100倍，混合菌液產(chǎn)丁酸是對(duì)照組的23倍。

混菌制劑應(yīng)用前后發(fā)酵出池酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)高通量測(cè)序結(jié)果及酒樣色譜數(shù)據(jù)表明，加入使得測(cè)試窖池微生物豐富度指數(shù)及數(shù)量得到顯著提升。在一定程度上測(cè)試前后，乳酸桿菌含量實(shí)驗(yàn)組降低效果顯著，產(chǎn)己酸等菌含量顯著增多，加菌測(cè)試起到“增己降乳”的作用，對(duì)己酸乙酯含量低的新窖池（如C02 車間）效果更顯著，提高基酒酒樣中風(fēng)味物質(zhì)總含量，提高濃香型主體香己酸乙酯含量。

窖池加混菌制劑發(fā)酵后，出池酒醅實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組殘余淀粉含量比例小，表明實(shí)驗(yàn)組中淀粉被相關(guān)微生物分解得更充分，發(fā)酵更為充分，酒醅發(fā)酵程度提高，改善窖泥pH 值，提高窖泥中己酸菌活躍度。酒醅發(fā)酵后的風(fēng)味物質(zhì)總含量提高，且己酸、己酸乙酯含量增多，乳酸乙酯含量減少。

綜上結(jié)果表明，混菌制劑的加入能夠使得己酸菌活躍程度提高，提高濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的己酸乙酯含量，同時(shí)降低乳酸乙酯含量，且呈香物質(zhì)的總量高、出池酒醅淀粉殘余量小，發(fā)酵更充分。