關(guān)于微生物法測定米粉中維生素B6含量不確定度評估

戴明男

（中紡檢測（福建）有限公司，福建泉州 362000）

維生素B6又可稱之為吡哆素，包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等多個(gè)成分，可溶于水，參與人體多種代謝反應(yīng)。維生素B6是米粉中重要營養(yǎng)組成之一，但因含量處于較低的水平，測定難度較大?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B6的測定》（GB 5009.154—2016）規(guī)定了食品中維生素B6的含量測定方法，微生物法為標(biāo)準(zhǔn)第二法，適用于不同類別食品中維生素B6的測定。本文評估了利用GB 5009.154—2016第二法測定米粉中維生素B6含量的不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料

SHP-250型生化培養(yǎng)箱、Thermo酶標(biāo)檢測儀、多管式旋渦混合器、水浴鍋、0.2 μm無菌濾膜[1]。市售嬰幼兒配方米粉、維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.0%），檸檬酸鹽緩沖液（pH為4.5）、馬鈴薯酸性磷酸酶、無菌水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 操作步驟

在250 mL錐形瓶內(nèi)，放入2.5 g米粉樣品，利用單標(biāo)線吸量管加入0.05 L檸檬酸鹽緩沖液后、0.025 L馬鈴薯酸性磷酸酶，在多管式旋渦混合器內(nèi)混合均勻。進(jìn)而放置在無光照直射的37.0 ℃室溫環(huán)境中，孵育60 min，間隔手動振蕩[2]。孵育完畢后，加入0.1 L滅菌水逐級稀釋，在95.0 ℃水浴鍋內(nèi)振蕩，在短時(shí)間內(nèi)冷卻至室內(nèi)溫度后過濾、無菌離心取上清液[3]。進(jìn)而依據(jù)GB 5009.154—2016第二法，配制0 mg/100 g、0.002 mg/100 g、0.004 mg/100 g、0.006 mg/100 g、0.008 mg/100 g的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取微孔板條，在30.0 ℃無光照直射條件下孵育。孵育后，在Thermo酶標(biāo)檢測儀中，選擇630 nm波長，進(jìn)行吸光度讀取[4]。

1.2.2 測定計(jì)算

GB 5009.154—2016第二法規(guī)定米粉中維生素B6含量需要依據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

X=C×n×m×0.822 （1）

式（1）中：X為維生素B6含量，C為樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線下讀取的濃度，n為稀釋倍數(shù)，m為樣品量[5]。其中維生素B6含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式（2）中：Urel(X)為維生素B6含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，Urel(C)為樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線下讀取的濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，Urel(n)為稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，Urel(m)為樣品量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品稱量引入的不確定度

用電子天平精準(zhǔn)稱量樣品2.500 1 g，天平精確度為0.1 mg。由天平鑒定證書可知天平最大重復(fù)性誤差為0.15 mg，在稱取量大于0 g但小于50 g時(shí)，指示數(shù)值誤差為0.1 mg。利用矩陣分布包含因子為的B類不確定性標(biāo)定，得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為合成標(biāo)準(zhǔn)不確定式則樣品稱量時(shí)的相對不確定度為0.080 75/2.500 1≈0.032 30。

2.2 樣品稀釋定容引入的不確定度

上述操作用儀器均為玻璃材質(zhì)，玻璃材質(zhì)校準(zhǔn)、溫度干擾均對液體體積具有影響，進(jìn)而引發(fā)維生素B6測定偏差。根據(jù)最大允許誤差，依據(jù)包含因子k為的均勻分布處理方法進(jìn)行不確定度分量計(jì)算，可得出5 mL單標(biāo)線吸量管最大允許誤差為±0.015，不確定度為0.008 66，相對不確定度為0.001 68；而250 mL單標(biāo)線容量瓶最大允許誤差為±0.15，不確定度為0.086 6，相對不確定度為0.000 339，合成剝離器具校準(zhǔn)引入的不確定度分量為

考慮到微生物測定區(qū)域溫度變化幅度在5.0 ℃左右，水膨脹系數(shù)為0.000 21 ℃，依據(jù)包含因子k為的矩形分布計(jì)算可知，因室溫變化而引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為合成溫度變化引起的操作用儀器相對不確定度分量可得出結(jié)果為0.000 857 0，則樣品稀釋形容引入的不確定度就為

2.3 樣品測量中引入的不確定度

樣品測量不確定性主要源于測量重復(fù)性。對定值樣品中的維生素B6含量進(jìn)行平行測定，測定次數(shù)為8，得出結(jié)果分別結(jié)果如表1所示。根據(jù)貝塞爾公式，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度約等于0.000 363。則微生物法測定米粉中維生素B6的總不確定度為：0.032 30+0.087 034 2+0.000 363=0.119 697 2。

表1 樣品重復(fù)性測定結(jié)果（n=8）

3 結(jié)論

微生物法測定米粉中維生素B6含量不確定度主要來源于樣品稱量、樣品稀釋定容、樣品測量等幾個(gè)環(huán)節(jié)，涉及了標(biāo)準(zhǔn)品純度、天平自身精密度、移液器與容量瓶容差、樣品測定重復(fù)性、試驗(yàn)環(huán)節(jié)溫度變化等幾個(gè)方面。測定人員應(yīng)嚴(yán)格依據(jù)GB 5009.154—2016的要求，進(jìn)行微生物法操作，為米粉安全監(jiān)管提供充足支持。