應(yīng)用液態(tài)懸浮芯片技術(shù)建立17 種大腸桿菌耐藥基因多重快速檢測方法

韓天飛，趙建梅，劉 娜，張青青，王 娟，張喜悅，劉俊輝，李月華，黃秀梅，王君瑋，曲志娜，祁克宗

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036）

在人醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中，抗菌藥耐藥性關(guān)系著全球健康問題[1-3]。當(dāng)前耐藥形勢不容樂觀，細(xì)菌對各類抗菌藥均有不同程度的耐藥，且耐藥基因種類繁多、分布廣泛，涉及的動(dòng)物物種范圍較廣，包含家禽[4]、大型牲畜[5]以及伴侶動(dòng)物，其中養(yǎng)殖場中的豬源[6]和禽源[7]菌株耐藥基因檢出率較高。流行率和檢測率較高的耐藥基因多數(shù)能在質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)元件上被檢出，并以水平傳播方式擴(kuò)散。當(dāng)前，PCR 檢測方法仍然是耐藥基因檢測的主要方法，但因耗時(shí)長、通量低、靈敏度弱而阻礙了耐藥基因檢測工作。

液態(tài)芯片平臺(tái)具有靈活的開放式體系結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，可以快速、經(jīng)濟(jì)高效且準(zhǔn)確執(zhí)行各種測定[8]。作為一個(gè)開放式架構(gòu)平臺(tái)，研究人員可根據(jù)檢測的目標(biāo)基因設(shè)計(jì)用于雜交的探針，利用多重PCR 對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在反應(yīng)體系中被擴(kuò)增的目的片段會(huì)被標(biāo)記上對應(yīng)的報(bào)告熒光，且對應(yīng)的探針標(biāo)記靶向DNA，使其與包被在微球上的互補(bǔ)捕獲探針直接雜交[8-9]。

隨著細(xì)菌耐藥狀況的不斷加劇，已有多項(xiàng)研究證明液態(tài)芯片技術(shù)可用于多重耐藥菌的檢測。李婧嬋[8]使用液態(tài)芯片技術(shù)檢測多重耐藥結(jié)核分枝桿菌，發(fā)現(xiàn)最低檢測濃度可達(dá)1 ng/mL；孫青菊等[9]建立了一套8 重檢測體系，可以對銅綠假單胞菌中常見的OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB和IMP共8 個(gè)耐藥基因進(jìn)行檢測，選擇了8 株含各耐藥基因的銅綠假單胞菌陽性菌株，用建立的方法重復(fù)檢測10 次，發(fā)現(xiàn)耐藥基因檢測陽性率為100%；韓明明[10]在耐多藥結(jié)核病檢測中使用此項(xiàng)檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)液態(tài)芯片法準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、成本低，可在1 個(gè)工作日內(nèi)完成多個(gè)樣本檢測，尤其在混合感染檢測時(shí)具有很大優(yōu)勢。

目前，針對大腸桿菌感染引起的疾病，獸醫(yī)臨床用藥主要為β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、酰胺醇類、黏多菌素類、喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類。本研究選取這7 類抗菌藥物中常見的17 種大腸桿菌耐藥基因，旨在通過液態(tài)芯片平臺(tái)建立一種快速、高通量的多重耐藥基因檢測方法，用于細(xì)菌常見耐藥基因檢測及耐藥菌流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株blaSHV、blaCMY-1、Aph3-IIa-1、aac(6)-Ib-cr、aadA-1、cmlA-1、gyrA、mcr-1、NDM-1、parC、qnrS-1、sul-1、sul-2、sul-3、tetA、tetB、tetX基因陽性菌株，由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心致病微生物監(jiān)測室保存。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌瓊脂粉、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、LB 肉湯培養(yǎng)基，均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂糖、50×TAE、GoTaqGreen Master Mix、Nuclease-Free Water、溴化乙錠溶液，均購于上海生工生物有限公司；MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0、pMD?18-T Vector Cloning Kit 和DL 2000TMDNA Marker，均購于TaKaRa 生物技術(shù)有限公司；DH5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；氨芐青霉素鈉，購自Sigma；鏈霉親和素（Streptavidin，R-Phycoerythrin，SAPE），購自Thermo Fisher Scientific。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜（萬心順昌科技有限公司）、培養(yǎng)箱（上海愛朗儀器有限公司）、振蕩器（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）、水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表公司）、快速混勻器（中外合資深圳天南海北有限責(zé)任公司）、Centrifuge 5415 D 型高速臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf 公司）、電泳儀（北京六一儀器廠）、GeneMax PCR 儀（杭州博日科技有限公司）、Gel Image System 凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、超微量核酸蛋白測定儀（IMPLEN）、電熱恒溫水浴鍋（上海恒躍醫(yī)療器械有限公司）、Luminex?200（Luminex Corporation）。

1.2 方法

1.2.1 耐藥基因設(shè)計(jì) 從GenBank 中下載17種耐藥基因參考序列，運(yùn)用Laser gene 6 軟件進(jìn)行序列比對。選取最保守的一段序列，將其在PrimerPlex 軟件中設(shè)置產(chǎn)物大小差異、引物和產(chǎn)物解鏈溫度、5'和3'端最大ΔG 值以及GC 含量等參數(shù)，以找出最優(yōu)引物組合。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表1。

1.2.2 耐藥基因陽性質(zhì)粒構(gòu)建 使用表1 中的特異性引物分別擴(kuò)增目的基因，并將其與pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，隨后測定重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度，并用質(zhì)粒質(zhì)量濃度-拷貝數(shù)換算公式計(jì)算拷貝數(shù)。拷貝數(shù)（copies/μL）=6.02×1023× 質(zhì)粒質(zhì)量濃度（ng/μL）×10-9/（質(zhì)粒堿基數(shù)×660）。

表1 17 種耐藥基因引物設(shè)計(jì)

1.2.3 液態(tài)芯片引物合成與修飾 根據(jù)Luminex cookbook 中所提供的資料，選擇適用于Luminex 200TM液態(tài)芯片檢測儀的Magplex-TAG 微球。對17 種耐藥基因特異性引物進(jìn)行如下修飾：上游引物的5'端用TAG 序列連接，在上游引物序列的5'端和TAG 序列的3'端之間插入C12；將生物素標(biāo)記在下游引物的5'端，便于與SAPE 進(jìn)行反應(yīng)。帶修飾的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.4 雜交條件優(yōu)化 將多重PCR 產(chǎn)物（5 μL）、SAPE 報(bào)告液（75 μL）和微球工作液（20 μL）混合，隨后震蕩懸浮，混勻后放入PCR 儀，設(shè)置合適的溫度與孵育時(shí)長，使PCR 產(chǎn)物與微球雜交。

1.2.5 液態(tài)芯片方法評價(jià) 特異性試驗(yàn)：將制備的陽性質(zhì)粒作為模板，設(shè)置陰性和陽性對照組，取5 μL PCR 產(chǎn)物，利用建立的液態(tài)芯片檢測方法進(jìn)行特異性檢測；敏感性試驗(yàn)：將制備的陽性質(zhì)粒進(jìn)行10 倍倍比稀釋，將不同濃度的陽性質(zhì)粒作為模板，分別進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，隨后用建立的液態(tài)芯片檢測方法進(jìn)行敏感性檢測；穩(wěn)定性試驗(yàn)：在試驗(yàn)條件完全相同的情況進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性；有效性試驗(yàn)：使用建立的液態(tài)芯片法，對臨床樣本中分離的大腸桿菌進(jìn)行耐藥基因檢測，并與PCR 方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較，檢驗(yàn)液態(tài)芯片法的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥基因陽性質(zhì)粒

對構(gòu)建的17 種耐藥基因陽性質(zhì)粒進(jìn)行3 次濃度測定，取平均值作為最終濃度。17 種陽性質(zhì)粒的拷貝數(shù)詳情見表2。

2.2 雜交條件優(yōu)化

17 種耐藥基因總共分為兩個(gè)多重檢測體系，即體系一（system-1，S-1）：qnrS-1、sul-3、sul-2、tetB、sul-1、aadA-1、aac(6)-Ib-cr、gyrA和Aph3-IIa-1；體系二（system-2，S-2）：tetA、mcr-1、tetX、cmlA-1、NDM-1、blaSHV、blaCMY-1和parC（表2）。S-1 和S-2 的最佳雜交條件分別為20 ℃ 30 min 和30 ℃ 35 min。

2.3 特異性

單模板檢測結(jié)果（圖1～2）顯示，每次試驗(yàn)中只能擴(kuò)增出單一模板，并呈現(xiàn)較高的陽性信號(hào)值，而對于非目的基因則顯示陰性，且陽性對照與陰性對照成立，說明建立的液態(tài)芯片檢測方法特異性較好。

圖1 S-1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性

S-1 單一質(zhì)粒檢測靈敏度最高的基因是aadA-1和aac(6)-Ib-cr，拷貝數(shù)分別為6.28×102和6.61×102，靈敏度最低的是sul-2和Aph3-IIa-1，拷貝數(shù)分別為6.29×104和3.68×104，其余基因的靈敏度均為10-6；S-1 混合質(zhì)粒檢測靈敏度最低的基因是Aph3-IIa-1，拷貝數(shù)為3.68×105，其余基因的靈敏度為10-5或10-6，詳見表2。

S-2 單一質(zhì)粒檢測靈敏度最高的基因是blaCMY-1，拷貝數(shù)為6.40×102，靈敏度最低的是tetA和NDM-1，拷貝數(shù)分別為2.41×105和8.28×105，其余基因的靈敏度均為10-5或10-6。S-2 混合質(zhì)粒檢測靈敏度最低的基因是tetA，拷貝數(shù)為2.41×106，靈敏度最高的為10-6，詳見表2。

2.5 液態(tài)芯片有效性

S-1 和S-2 的液態(tài)芯片檢測結(jié)果與常規(guī)PCR檢測結(jié)果經(jīng)符合率計(jì)算，Kappa 值在0.41～0.60內(nèi)的有sul-2、tetB、aadA-1、gyrA、Aph3-Ⅱ-a和blaCMY-1，具有中等的一致性；Kappa 值在0.61～0.80 內(nèi)的有qnrS-1、sul-3、sul-1、aac(6')-Ibcr、tetX和cmlA-1，具有高度的一致性（substantial）；Kappa 值在0.81～1.00 內(nèi)的有tetA、mcr-1、NDM-1、blaSHV和parC，幾乎完全一致，詳見表2。

表2 敏感性檢測結(jié)果及Kappa 值

3 討論

本研究從β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類、多粘菌素類、酰胺醇類和四環(huán)素類中分別選取最為流行或極為重要耐藥基因共17 種，分別是blaCMY-1、blaSHV、NDM-1、aac(6')-Ibcr、qnrS-1、parC、gyrA、aadA-1、Aph3-IIa-1、sul-1、sul-2、sul-3、mcr-1、cmlA、tetX、tetA和tetB，將其分別組合成兩種多重檢測體系，在檢測前針對不同體系選擇對應(yīng)體系中的微球編號(hào)，具體試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置參考多種豬源性外來病液態(tài)芯片檢測方法[11]。

圖2 S-2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)原計(jì)劃將17 種基因開發(fā)成一個(gè)檢測體系，但由于多重PCR 技術(shù)的局限性，在10 重體系的研發(fā)中出現(xiàn)了難以調(diào)試的問題，不得不分解成兩個(gè)體系進(jìn)行再次開發(fā)，最終形成了8 重體系和9 重體系，這與孫青菊等[12]建立的8 重耐藥基因檢測體系較為接近。其中最為重要的是對多重PCR 的優(yōu)化過程。試驗(yàn)對不同基因所設(shè)計(jì)的引物均具有十分良好的特異性，在單一獨(dú)立擴(kuò)增條件下均能擴(kuò)增出純凈條帶；在進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增時(shí)，優(yōu)先選擇使體系中所有基因都能擴(kuò)增的退火溫度，其次選擇較高的退火溫度，從而使擴(kuò)增過程中的特異性更好。此外，在多重PCR 擴(kuò)增體系中，各種目的基因的引物濃度應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的情況有所調(diào)整。本研究中的多重PCR 體系為50 μL，經(jīng)過多次配比，每種基因的引物工作濃度范圍為0.1～0.8 μmol/L。

本研究建立的兩個(gè)體系均通過了特異性、靈敏度和有效性試驗(yàn)。在特異性檢驗(yàn)中，純凈的單一質(zhì)粒試驗(yàn)中的熒光中位值（MFI）要高于混合質(zhì)粒試驗(yàn)，質(zhì)?？截悢?shù)高的陽性數(shù)值也大于拷貝數(shù)低的，總體來說檢測數(shù)值會(huì)隨著被檢測物濃度的變化而產(chǎn)生相應(yīng)的變化，具有半定量的效果[13]。靈敏度試驗(yàn)中，單一模板條件下的S-1 和S-2 最低檢測量均為102copies/μL，而混合質(zhì)粒檢測中的S-1 最低檢測量為103copies/μL，最低檢測量S-2 為102copies/μL。相比而言，體系中檢測重?cái)?shù)較低的敏感性也相對較好，但兩個(gè)體系的敏感性數(shù)值并不優(yōu)良，個(gè)別基因的檢測靈敏度相對較差，如tetA 的檢測靈敏度為10-3，最低檢測量為2.41×106copies/μL。液態(tài)芯片法與PCR 方法相比具有較好的靈敏度和特異性，兩種方法的檢測結(jié)果具有較高的一致率。19 株臨床樣品檢測結(jié)果顯示，S-1 和S-2 的適用性良好，這可能是因?yàn)榕R床樣本大腸桿菌中提取的基因組含量較高，適用于各基因的最低檢測量，有一定的實(shí)用性。

液態(tài)芯片檢測方法作為新型檢測技術(shù)具有較大潛力，但首先需要克服一些缺點(diǎn)。其在核酸檢測應(yīng)用上更多的是依賴多重PCR 技術(shù)，這使得PCR技術(shù)中所暴露的缺點(diǎn)在液態(tài)芯片檢測方法中依舊存在——檢測環(huán)境開放、人為操作偏差、核酸污染等，最為突出的一點(diǎn)是對于多重?cái)?shù)量的限制，一旦體系中的被檢重?cái)?shù)增多，整個(gè)體系的穩(wěn)定性和非特異性就會(huì)變差。此外，試劑耗材成本相比于普通的核酸檢測技術(shù)較為高昂，這在一定程度上限制了該項(xiàng)技術(shù)的推廣使用。目前國內(nèi)只有透景公司應(yīng)用此技術(shù)研發(fā)的HPV 核酸檢測試劑通過了國家食品藥品監(jiān)督管理局的上市批準(zhǔn)[14]。

近年來，液態(tài)芯片作為一種高通量、高敏感性的新型檢測技術(shù)，發(fā)展十分迅速，被廣泛應(yīng)用于耐藥性檢測、傳染病臨床診斷，包括食源性污染微生物的篩查、多重呼吸道病毒感染及感染病原的亞型鑒別等方面[12-13，15-17]，還探究應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)、農(nóng)學(xué)、食品科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。作為一個(gè)開放性的技術(shù)平臺(tái)，液態(tài)芯片技術(shù)有著十分巨大的研究價(jià)值和廣闊的應(yīng)用空間，各行各業(yè)的研究人員可以根據(jù)不同的需求對其進(jìn)行不同檢測項(xiàng)目的開發(fā)，同時(shí)也讓科研人員在更多的領(lǐng)域有了新的研究手段，為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)提供了更多的解決方案。隨著國內(nèi)外公司逐漸研發(fā)和優(yōu)化商品化試劑和檢測平臺(tái)，液態(tài)芯片很可能成為一種更具實(shí)用價(jià)值、更高效準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，尤其在新冠肺炎疫情流行形勢下，針對病毒分型和核酸檢測，液態(tài)芯片技術(shù)將有著更為廣闊的應(yīng)用前景。