鴨源雞桿菌平板凝集檢測方法的建立與應(yīng)用

張玉杰，劉紅祥，劉 東，張 翔，杜元釗

（青島易邦生物工程有限公司，動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東青島 266114）

鴨源雞桿菌（Gallibacterium anatis）作為巴氏桿菌科雞桿菌屬的一個代表種[1]，常引起開產(chǎn)蛋雞輸卵管炎、輸卵管囊腫和敗血癥等生殖系統(tǒng)疾病[2]，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降。臨床上，青年雞感染該菌后無明顯臨床表現(xiàn)，不易被察覺，直到雞群開產(chǎn)后，由于各種應(yīng)激因素刺激，感染雞群常突然發(fā)病，造成極大經(jīng)濟損失。

20 世紀(jì)90 年代，我國北方地區(qū)開產(chǎn)后的蛋種雞或肉種雞在經(jīng)3～5 輪人工授精后，出現(xiàn)嚴(yán)重的產(chǎn)蛋下降或孵化率降低現(xiàn)象，但對其病因長時間內(nèi)未有明確定論。直到2019 年初，張玉杰等[3]對我國人工授精后的蛋種雞或肉種雞產(chǎn)蛋下降問題進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并證實該病病原是鴨源雞桿菌。臨床上，該細(xì)菌與新城疫病毒（非典型新城疫）、雞傳染性支氣管炎病毒、禽腦脊髓炎病毒、禽腺病毒EDS-76 等[4]引起的臨床癥狀相似，不易區(qū)分，臨床鑒別診斷較為困難，需要進(jìn)行實驗室檢測。

目前，鴨源雞桿菌的檢測方法主要有細(xì)菌分離鑒定、ELISA、PCR、乳膠凝集試驗等[5-6]，而平板凝集試驗鮮有報道。本研究將已分離鑒定的鴨源雞桿菌YT-1 株制備成平板凝集抗原，初步建立了該菌的平板凝集檢測方法，并應(yīng)用該方法對全國不同地區(qū)雞場采集的雞血清樣品進(jìn)行了鴨源雞桿菌血清抗體檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨源雞桿菌YT-1 株，由青島易邦生物工程有限公司技術(shù)服務(wù)部檢測中心，自山東省煙臺市人工授精后產(chǎn)蛋下降的蛋種雞輸卵管內(nèi)分離鑒定并保存。雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、雞巴氏桿菌、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和禽腺病毒等病原的陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞臨床血清樣品436 份，采集自2020 年以來全國不同地區(qū)150～200 日齡的開產(chǎn)母雞；健康家兔（體質(zhì)量約2 kg），購自北京維通利華實驗動物中心；LB 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基、TSB 培養(yǎng)基，購自美國BD 公司；綿羊血平板培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；馬血清，購自HyClone 公司。

1.2 方法

1.2.1 鴨源雞桿菌復(fù)蘇和擴大培養(yǎng) 從-80 ℃低溫冰箱中取出凍存管，于37 ℃水浴中解凍，用接種環(huán)將其劃線接種在綿羊血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h；按照文獻(xiàn)[5]的方法，對復(fù)蘇菌落進(jìn)行鑒定；將鑒定好的菌落接種于綿羊血平板復(fù)壯，連續(xù)傳3代后用于抗原制備；挑取綿羊血平板上的單菌落接種于含5%馬血清的TSB 培養(yǎng)基中，200 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h，按照體積比1:100 接種于100 mL 新鮮TSB 培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行平板計數(shù)。

1.2.2 細(xì)菌滅活及檢驗 向菌液中加入0.2%的甲醛，37 ℃ 150 r/min 作用24 h 滅活細(xì)菌；將以上菌液4 000 r/min 離心5 min，棄掉上清液，用0.5%石炭酸生理鹽水洗滌菌泥3 遍，收集菌泥，再用0.5%石炭酸生理鹽水10 mL 重懸菌泥；取滅活后的菌液100 μL 涂布于綿羊血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h（此時應(yīng)無細(xì)菌生長）。

1.2.3 陽性和陰性血清制備 將制備好的鴨源雞桿菌抗原與白油佐劑按照體積比2:3 混合，乳化后皮下多點注射免疫健康家兔，1 mL/次（1010CFU），每隔7 d 免疫1 次，連續(xù)免疫3 次；三免后14 d，無菌心臟采血，分離血清分裝作為陽性血清；采集對照組健康家兔血清并分裝，作為陰性血清。以上血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 平板凝集試驗檢測方法建立 分別取30 μL 的陽性血清、陰性血清、抗原液和稀釋液至一張干凈的載玻片上，再用移液器各取30 μL 鴨源雞桿菌抗原液至載玻片上，分別與陽性血清、陰性血清、抗原液和稀釋液充分混勻，室溫靜置3 min后觀察。

1.2.5 抗原濃度調(diào)節(jié)及染色 將已知濃度的滅活菌液用0.5%石炭酸生理鹽水稀釋，調(diào)整其濃度為9×109、7×109、5×109、3×109和1×109CFU/mL 5 個梯度，然后用不同濃度的菌懸液與兔抗鴨源雞桿菌陽性血清進(jìn)行玻片凝集試驗，出現(xiàn)100%凝集現(xiàn)象的次高菌液稀釋度確定為鴨源雞桿菌抗原的最佳工作濃度。將該稀釋度菌液用石炭酸復(fù)紅染色，離心收集菌液，加入石炭酸復(fù)紅染色液至最佳工作濃度，充分搖勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 特異性試驗 用鴨源雞桿菌染色抗原，分別與該菌的雞源陽性血清、分離自健康雞的陰性血清，以及雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和禽腺病毒等病原的陽性血清進(jìn)行凝集試驗，檢測其特異性，同時設(shè)立兔血清陽性對照、陰性對照和稀釋液對照。

1.2.7 臨床樣品檢測 用本試驗建立的鴨源雞桿菌平板凝集試驗方法，對采集的460 份開產(chǎn)母雞血清進(jìn)行檢測，并結(jié)合病原分離結(jié)果初步判斷鴨源雞桿菌感染情況。

2 結(jié)果

2.1 平板凝集試驗

試驗結(jié)果（圖1）顯示：兔抗陽性血清與鴨源雞桿菌抗原液混合后發(fā)生100%凝集，而陰性血清、鴨源雞桿菌抗原液和0.5%石炭酸生理鹽水稀釋液與鴨源雞桿菌抗原液混合后均不凝集。

圖1 鴨源雞桿菌染色抗原凝集試驗結(jié)果

2.2 抗原最佳工作濃度

將5 個濃度梯度的抗原液分別與兔抗鴨源雞桿菌陽性血清進(jìn)行玻片凝集試驗。結(jié)果（表1）顯示：當(dāng)抗原濃度為5×109CFU/mL 時，抗原與血清凝集最佳，體系充分反應(yīng)，液體透明，凝集顆粒均勻分布于液滴表面，由此確定抗原的最佳工作濃度為5×109CFU/mL。

表1 鴨源雞桿菌抗原最佳工作濃度

2.3 抗原特異性檢測

特異性檢測結(jié)果（圖2）顯示，石炭酸復(fù)紅染色液染色的抗原與雞源陽性血清產(chǎn)生明顯凝集，而與雞源陰性血清以及雞大腸桿菌、雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、禽流感病毒、雞新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒和禽腺病毒等病原的陽性血清均不凝集。

圖2 鴨源雞桿菌染色抗原凝集試驗結(jié)果

2.4 臨床樣品檢測

對來自全國不同地區(qū)的460 份臨床血清樣品，采用建立的平板凝集試驗方法進(jìn)行檢測。結(jié)果（表2）顯示：①各地區(qū)鴨源雞桿菌血清抗體的陽性率從0～100%各不相同，不同品種雞均有感染。②蛋雞和蛋種雞陽性率大多高于白羽肉種雞，大部分人工授精的蛋種雞和肉種雞陽性率高達(dá)100%。③一些籠養(yǎng)種雞，在3～5 輪人工授精之后表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)蛋率或受精率下降現(xiàn)象，其中白羽肉種雞主要表現(xiàn)為受精率下降，而蛋種雞主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋率下降。④開產(chǎn)后“假母雞”無產(chǎn)蛋高峰，且存在輸卵管不發(fā)育或充盈透明液體現(xiàn)象。⑤人工授精的蛋種雞和肉種雞鴨源雞桿菌血清抗體陽性率與鴨源雞桿菌分離率完全一致，“假母雞”鴨源雞桿菌血清抗體陽性率略低于鴨源雞桿菌分離率。

表2 各地區(qū)雞場鴨源雞桿菌血清抗體檢測結(jié)果

3 討論

目前臨床上主要用PCR 和病原分離的方法進(jìn)行鴨源雞桿菌的病原學(xué)診斷[7-8]，用ELISA 方法進(jìn)行血清學(xué)檢測[6]。以上方法雖然特異性強、準(zhǔn)確性高，但細(xì)菌培養(yǎng)需要的營養(yǎng)條件比較苛刻，成本較高且不易操作，難以在基層養(yǎng)禽場推廣應(yīng)用。本研究建立的平板凝集試驗方法對試驗環(huán)境要求不高，但結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便快捷、易掌握、成本低，可用于快速診斷，適合于基層養(yǎng)殖場使用，亦可輔助實驗室開展大規(guī)模血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查。本研究選用鴨源雞桿菌YT-1 株作為抗原，能特異性地針對該菌引起的產(chǎn)蛋下降現(xiàn)象進(jìn)行血清學(xué)診斷，制備的抗原能特異性檢測出鴨源雞桿菌陽性血清，可用于不同地區(qū)雞群的鴨源雞桿菌流行病學(xué)調(diào)查。

對比不同雞群的鴨源雞桿菌平板凝集檢測結(jié)果與病原分離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法下人工授精的蛋種雞和白羽肉種雞檢測結(jié)果完全一致，“假母雞”的平板凝集檢測結(jié)果略低于病原分離結(jié)果。在實際生產(chǎn)中，動物機體往往在感染病原一定時間后，血清抗體才會轉(zhuǎn)陽，因此平板凝集試驗的結(jié)果要比病原分離的結(jié)果稍滯后[9]，但整體上并不影響結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性。本研究表明，不同檢測方法的檢測結(jié)果有一定差異，因此應(yīng)根據(jù)研究目的選擇合適的檢測方法。對于臨床診斷高度疑似病例，經(jīng)平板凝集檢測為陰性的應(yīng)采取病原分離展開進(jìn)一步檢測，以提高臨床診斷率，避免出現(xiàn)漏診與誤診現(xiàn)象。

本研究對來自全國不同地區(qū)的460 份血清進(jìn)行了鴨源雞桿菌血清流行病學(xué)篩查，初步了解了我國雞群中鴨源雞桿菌的流行情況，為后續(xù)加強對該病的綜合防控提供了依據(jù)。在被調(diào)查的14 個雞場中，有12 個雞場為鴨源雞桿菌抗體陽性場，說明鴨源雞桿菌感染在雞群中比較普遍，這與李喬晶等[10]的研究結(jié)果一致。不同品種蛋雞血清鴨源雞桿菌抗體陽性率為18.2%～42.0%，而非人工授精白羽肉種雞鴨源雞桿菌陽性率均在5%以內(nèi)，造成這種差異的原因可能是白羽肉種雞較蛋雞的飼養(yǎng)管理水平和生物安全水平高，這與Bojesen 等[11]、Lozica 等[12]對丹麥不同飼養(yǎng)方式健康產(chǎn)蛋雞的調(diào)查結(jié)果相似。在一些無產(chǎn)蛋高峰雞群的輸卵管內(nèi)分離到一定量的鴨源雞桿菌，且這些雞的輸卵管不發(fā)育或發(fā)育不完全（假母雞），這與Nassik 等[13]、王川慶等[14]的研究結(jié)果一致，表明該菌影響的靶器官主要是生殖系統(tǒng)，并可能參與了雞傳染性支氣管炎病毒對雛雞早期生殖系統(tǒng)的損傷過程。前期國內(nèi)外研究多認(rèn)為，該病原菌主要與蛋雞產(chǎn)蛋下降有關(guān)[15-16]，而缺少對種雞所產(chǎn)種蛋受精率的研究和報道。本研究通過血清學(xué)診斷技術(shù)揭示了該病原菌在種雞上的危害，與實驗室的前期研究結(jié)果相一致[3]。種雞人工授精技術(shù)是提高公雞利用率和母雞受精率，減少養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)雞效益的重要途徑。該檢測技術(shù)是現(xiàn)代種雞生產(chǎn)中極為重要的技術(shù)支撐，但應(yīng)注意采精和授精過程中的無菌操作以及種公雞是否攜帶致病原等，綜合做好雞群的健康管理是應(yīng)用該技術(shù)的重要前提。國外考慮到動物福利等因素，不施行人工授精技術(shù)，因此鮮有該病在種雞上的報道。