流行性出血病病毒阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒的研制

董仙蘭，王 瓊，韓佃剛，董 俊，楊云慶，祝 賀，葉玲玲，張 沖，尹尚蓮，李瑤瑤，何昌霖，羅倩敏，艾 軍

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南昆明 650223；3.昆明海關(guān)技術(shù)中心，云南昆明 650200）

流行性出血?。╡pizootic haemorrhagic disease，EHD）是由呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）的流行性出血病病毒（epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV）引起的，以侵害反芻動(dòng)物為主的一類蟲(chóng)媒性傳染病[1]。EHDV 通過(guò)庫(kù)蠓（Culicoides）吸血性叮咬傳播[2]，可感染包括鹿、牛、羊在內(nèi)的多種反芻動(dòng)物[3]，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展及國(guó)際貿(mào)易。

EHD 呈世界分布，廣泛分布于美洲、非洲、大洋洲以及亞洲的熱帶與亞熱帶地區(qū)[4]。我國(guó)的云南、貴州、四川、廣東和河北等多個(gè)省份均有EHD 流行[5-6]。目前在世界范圍已有9 種血清型的EHDV（EHDV-1、2、4、5、6、7、8、9、10）被發(fā)現(xiàn)。不同血清型病毒間缺乏交叉免疫保護(hù)，致病性也存在較大差異，因而給EHD 防控帶來(lái)極大挑戰(zhàn)[7]。我國(guó)主要流行5 種血清型EHDV（EHDV-1、5、6、7、8）[8-9]，不同血清型EHDV 毒株之間的核酸序列差異可達(dá)56.2%，同一種血清型不同地域分離毒株的Seg-2 核酸序列差異也可達(dá)29.4%[10-11]，表明流行于我國(guó)的EHDV具有高度的血清型多樣性，這給我國(guó)牛羊養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

目前國(guó)內(nèi)外EHDV 檢測(cè)方法主要分為病原檢測(cè)和抗體檢測(cè)，其中病原檢測(cè)包括病毒分離鑒定、RT-PCR、熒光定量RT-PCR、逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RT-RPA）以及特異性可視化RT-LAMP 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等[12]，抗體檢測(cè)包括競(jìng)爭(zhēng)ELISA（C-ELISA）、血清中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)等。而EHDV 檢測(cè)國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)ELISA 商品化試劑盒。本研究在BHK-21 細(xì)胞上增殖EHDV，滅活濃縮后，以制備的鼠源性EHDV 單克隆抗體為阻斷抗體，建立了一種EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測(cè)方法，并優(yōu)化反應(yīng)條件，試制了EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，以期為我國(guó)EHD 防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

BHK-21 細(xì)胞、EHDV-2 型病毒以及EHDV 單克隆抗體細(xì)胞株E2C5、臨床血清樣本，均為昆明海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存；IgG-HRP 羊抗鼠二抗，購(gòu)自KPL 公司（USA，貨號(hào)074-1806，1.0 mg），用抗體保護(hù)劑（USA，KPL 公司產(chǎn)品）按產(chǎn)品說(shuō)明書稀釋；ID Screen? EHDV Competition 檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自法國(guó)ID.vet 公司。

相關(guān)試劑：包被液，0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液（pH9.6）；封閉液，購(gòu)自Sigma 試劑公司；洗滌液，含0.5% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液；底物液（單組份可溶性TMB），購(gòu)自TIANGEN（中國(guó)）生物有限公司；終止液，1 mol/L 的硫酸。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備與粗提 用BHK-21 細(xì)胞增殖EHDV，滅活后超聲破碎；利用飽和硫酸銨進(jìn)行蛋白濃縮，測(cè)蛋白濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 腹水制備及純化（1）腹水制備：BALB/c小鼠腹腔注射降植烷，0.5 mL/只；1 周后腹腔注射單克隆抗體細(xì)胞E2C5，待小鼠腹部漲圓時(shí)，適時(shí)收取腹水。（2）腹水純化：腹水12 000 r/min 離心5 min，取上清5 mL，加入20 mL 醋酸緩沖液，混勻后，緩慢加入825 μL 辛酸，邊加邊攪動(dòng)；加完后繼續(xù)攪拌30 min，2～8 ℃ 12 000 r/min 離心30 min；將上清用濾紙過(guò)濾，并用1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0～7.4，按終體積45%的比例加入飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，加完繼續(xù)攪拌30 min，置于2～8 ℃沉淀4～5 h；2～8 ℃ 12 000 r/min離心30 min；用3 mL Tris-HCl 將沉淀重懸，裝入透析袋（MW 8 000～14 000），在Tris-HCl 中于2～8 ℃透析14 h，12 000 r/min 離心5 min，取上清用Tris-HCl 定容至5 mL，即獲得提純單抗。

1.2.3 EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測(cè)方法建立

1.2.3.1 抗原最佳包被濃度和單克隆抗體最佳稀釋度確定 用0.05 mol/L pH9.6 的碳酸鹽緩沖液，將制備好的抗原按1:25、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1 000 稀釋包被；單克隆抗體按1:25、1:50、1:100、1:200 稀釋，IgG-HRP 羊抗鼠二抗作1:1 000 稀釋，進(jìn)行方陣滴度試驗(yàn)，以確定抗原最佳包被濃度和單抗的最佳稀釋度。

1.2.3.2 樣品稀釋液確定 分別使用磷酸鹽緩沖液、含1%BSA 的磷酸鹽緩沖液、含5%BSA 的磷酸鹽緩沖液，以及含0.5% BSA、0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行阻斷ELISA 檢測(cè)，確定最佳樣品稀釋液。

1.2.3.3 待檢血清和IgG-HRP 羊抗鼠二抗最佳稀釋度確定 參照ID Screen? EHDV Competition 檢測(cè)試劑盒，將血清分別進(jìn)行1:2、1:2.5、1:5、1:10稀釋，IgG-HRP 羊抗鼠二抗分別作1:500、1:1 000、1:2 000、1:2 500 稀釋，進(jìn)行方陣滴度試驗(yàn)，以確定待檢血清和IgG-HRP 羊抗鼠二抗最佳稀釋度。

1.2.3.4 封閉液選擇 分別以1%、5%、10%的BSA 以及1%的明膠、1%的馬血清作為封閉液進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳封閉液。

1.2.3.5 各程序最佳時(shí)間確定 在已經(jīng)確定的最優(yōu)條件下，檢測(cè)6 份不同陰性臨床樣品，逐一確定最佳封閉時(shí)間（4 ℃過(guò)夜、37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h）、待檢血清最佳反應(yīng)時(shí)間（30、45、60 min）、單克隆抗體最佳反應(yīng)時(shí)間（30、45、60 min）、IgGHRP 羊抗鼠二抗反應(yīng)時(shí)間（30、45、60 min）和底物最佳作用時(shí)間（5、10、15、20 min）。

1.2.3.6 阻斷ELISA 臨界值確定 運(yùn)用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 方法檢測(cè)90 份陰性參考血清，根據(jù)S/M確定陰陽(yáng)性臨界值確定研制的EHDV阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒的判定標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算公式：S/M=血清樣品OD 值/ 單克隆抗體對(duì)照孔平均OD 值）×100%。

1.2.3.7 阻斷ELISA 方法特異性確定 用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 法，對(duì)EHDV-1、5、6、7、8型血清，以及藍(lán)舌病病毒（BTV）、小反芻獸疫病毒（PPRV）、口蹄疫O 型病毒（FMDV-O）、赤羽病病毒（AKV）、水泡性口炎病毒（VSV）的陽(yáng)性血清（BHK 細(xì)胞免疫山羊制備）和BHK 細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，以確定該方法的特異性。

1.2.3.8 阻斷ELISA 方法敏感性確定 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清分別進(jìn)行1:20、1:40、1:60、1:80 稀釋，用ID Screen? EHDV Competition 檢測(cè)試劑盒和本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 法進(jìn)行對(duì)比測(cè)試，以確定該試劑盒的敏感性。

1.2.3.9 阻斷ELISA 方法符合率確定 用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 法和ID Screen? EHDV Competition 檢測(cè)試劑盒同時(shí)對(duì)應(yīng)檢測(cè)臨床樣品，從而計(jì)算該方法與商品化試劑盒的符合率。

1.2.3.10 阻斷ELISA 方法批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次試制的試劑盒，對(duì)經(jīng)ID Screen? EHDV Competition 試劑盒檢測(cè)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.3.11 阻斷ELISA 方法批間重復(fù)性試驗(yàn) 取不同批次試制的試劑盒，對(duì)經(jīng)ID Screen? EHDV Competition 試劑盒檢測(cè)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.3.12 保存期試驗(yàn) 將組裝的試劑盒中各試劑密封（顯色液避光保存），包被好的ELISA 板放于避光封口袋中封口，全部放于4 ℃存儲(chǔ)。試劑性狀檢測(cè)：在保存期間，每隔1 個(gè)月觀察1 次組裝試劑盒中各試劑性狀，若試劑清澈、透明、無(wú)絮狀沉淀判為合格。敏感性檢測(cè)：每個(gè)月對(duì)組裝試劑盒敏感性進(jìn)行1 次檢測(cè)，取EHDV 陽(yáng)性血清作1:10～1:60 倍比稀釋，然后用該試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 抗體檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其檢出為陽(yáng)性的最低血清濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測(cè)方法建立

2.1.1 最佳包被濃度及最佳稀釋度確定 在二抗?jié)舛葹?:1 000 稀釋的條件下，進(jìn)行抗原和單抗的矩陣篩選，發(fā)現(xiàn)抗原1:100（27.3 μg/mL）稀釋時(shí)，OD 值在1.0 以上，考慮到ELISA 檢測(cè)儀讀數(shù)的精確度，抗原最佳包被濃度為1:100（27.3 μg/mL），單克隆抗體最佳稀釋度為1:100；同樣的方法可得待檢血清最佳稀釋度為1:2.5，IgG-HRP 羊抗鼠二抗最佳稀釋度為1:1 000。稀釋液選擇結(jié)果顯示，含0.5% BSA、0.05% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液稀釋樣品時(shí)，陰性血清OD 值最接近1.0，同時(shí)PI值最大，因此確定最佳稀釋液為含0.5% BSA、0.05% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液。

2.1.2 最佳反應(yīng)條件選擇 用不同的封閉液同時(shí)對(duì)陽(yáng)性、弱陽(yáng)、陰性血清測(cè)試，考慮到試劑盒穩(wěn)定性，確定最佳包被條件為4 ℃過(guò)夜，最佳封閉液為5%的BSA，最佳封閉條件為37 ℃ 1 h，待檢血清最佳反應(yīng)條件為37 ℃ 45 min，單克隆抗體最佳反應(yīng)條件為37 ℃ 45 min，IgG-HRP 羊抗鼠二抗最佳反應(yīng)條件為37 ℃ 45 min，底物最佳作用條件為37 ℃靜置15 min。

2.1.3 臨界值確定 運(yùn)用本試驗(yàn)建立的EHDV 阻斷ELISA 抗體檢測(cè)方法檢測(cè)90 份陰性參考血清，求得90 份陰性參考血清的平均值=78.41，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）=6.34，確定陰陽(yáng)性臨界點(diǎn)為-3SD=59.40，即待檢血清的檢測(cè)結(jié)果S/M＜60時(shí)判為陽(yáng)性，≥60 時(shí)判為陰性。

2.2 操作程序

本研究通過(guò)EHDV 抗原和單克隆抗體，建立了檢測(cè)EHDV 的阻斷ELISA 抗體檢測(cè)方法，并對(duì)該檢測(cè)方法的各個(gè)步驟進(jìn)行了條件優(yōu)化，確定了此方法的最佳操作程序：用0.05 mol/L pH9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋濃縮的EHDV 至1:100（27.3 μg/mL），100 μL/孔過(guò)夜包被板；PBST 洗板3 次，300 μL/孔，拍干；加入5%的封閉液37 ℃封閉60 min；PBST洗板3 次，300 μL/孔，拍干；加入1:2.5 稀釋的待檢血清，50 μL/孔，37 ℃作用45 min；不洗板，加入1:100 稀釋的單克隆抗體，37 ℃反應(yīng)45 min；PBST 洗板3 次，300 μL/孔，拍干；加入1:1 000稀釋的IgG-HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)45 min；PBST 洗板3 次，300 μL/孔，拍干；加入底物液，100 μL/孔，37 ℃避光靜置顯色15 min；加終止液，100 μL/孔終止反應(yīng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD450nm值，根據(jù)公式計(jì)算S/M值。

2.3 特異性確定

用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA法，對(duì)EHDV-1、5、6、7、8 型血清，以及BTV、PPRV、FMDV-O、AKV、VSV 陽(yáng)性血清（BHK 細(xì)胞免疫山羊制備）和BHK 細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)S/M值分別為20.87、19.89、18.96、21.25、21.56、67.38、80.11、93.21、84.56、83.28、73.74，根據(jù)臨界值判定EHDV-1、5、6、7、8 型病毒為陽(yáng)性，其他病毒為陰性，表明該方法有良好的特異性。

2.4 敏感性確定

用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 抗體檢測(cè)方法和ID Screen? EHDV Competition 試劑盒同時(shí)檢測(cè)1:10、1:20、1:40、1:60、1:80 稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明該試劑盒具有較好的敏感性。

2.5 符合率確定

用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒和ID Screen? EHDV Competition 試劑盒同時(shí)檢測(cè)臨床樣品200 份，發(fā)現(xiàn)與參考試劑盒的符合率達(dá)97.00%，Kappa 值為0.93（表1）。

表1 兩種試劑盒200 份臨床樣品的ELISA 抗體檢測(cè)結(jié)果 單位：份

2.6 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次試制的EHDV ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)6 份不同陰性、陽(yáng)性臨床樣本，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)為2.67%～8.70%（表2），說(shuō)明該方法具有良好的可重復(fù)性。

表2 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 %

2.7 批間重復(fù)性試驗(yàn)

取不同批次試制的EHDV ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)6 份不同陰性、陽(yáng)性臨床樣本，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)為3.14%～9.02%（表3），說(shuō)明該方法具有良好的可重復(fù)性。

表3 批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 %

2.8 保存期試驗(yàn)

取組裝的同批次試劑6 盒，置于4 ℃。在保存的6 個(gè)月內(nèi)，每月隨機(jī)選取1 個(gè)試劑盒，進(jìn)行試劑性狀和敏感性檢測(cè)試驗(yàn)。試劑性狀檢測(cè)結(jié)果顯示，各試劑均清澈、透明、無(wú)絮狀沉淀存在。敏感性檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，在6 個(gè)月內(nèi)，組裝試劑盒的最低陽(yáng)性檢出稀釋度均為1:40。

表4 保存期試驗(yàn)結(jié)果 %

3 討論

我國(guó)內(nèi)地雖然在牛羊血清中檢測(cè)到了EHDV陽(yáng)性抗體，但暫無(wú)EHD 暴發(fā)記錄。曹穎穎等[13]利用微量細(xì)胞中和試驗(yàn)開(kāi)展EHDV 血清型調(diào)查，在廣西黃牛、奶牛血清中檢出EHDV-5、6、7、8 型中和抗體，同時(shí)也分離出EHDV-5、8 型毒株，說(shuō)明廣西境內(nèi)存在EHDV 感染，并存在EHDV-5、8血清型流行。楊振興等[5]在云南省牛和山羊的體內(nèi)均檢測(cè)出了EHDV 抗體，朱沛等[14]在云南省反芻動(dòng)物的體內(nèi)分離出EHDV-5 型毒株，說(shuō)明云南省反芻動(dòng)物中存在EHDV 感染。因此，預(yù)防及控制該病是當(dāng)前我國(guó)面臨的問(wèn)題。而開(kāi)發(fā)EHDV 血清型特異性診斷技術(shù)，對(duì)深入開(kāi)展我國(guó)EHD 流行病學(xué)調(diào)查與防控技術(shù)研究均具有重要實(shí)際意義。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化的ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，而國(guó)外的抗體檢測(cè)試劑盒較昂貴，且不能滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求，因此本研究有很強(qiáng)的實(shí)際意義。

用本研究建立的阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，對(duì)我國(guó)已鑒定到的EHDV-1、5、6、7、8 陽(yáng)性血清進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果均是陽(yáng)性，說(shuō)明該試劑盒對(duì)EHDV具有一定通用性，同時(shí)對(duì)BTV、FMDV-O、AKAV陽(yáng)性血清和BHK 細(xì)胞均是陰性，說(shuō)明該試劑盒具有良好的特異性，能較好地與其他病毒進(jìn)行特異性區(qū)分；可檢測(cè)的最高陽(yáng)性血清濃度為1:60，與ID Screen? EHDV Competition 試劑盒敏感性一致。

我國(guó)是牛羊養(yǎng)殖大國(guó)，對(duì)EHD 進(jìn)行防控，需進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，如果用國(guó)際通用的ID Screen?EHDV Competition 試劑盒，則檢測(cè)成本較高，將花費(fèi)大量經(jīng)費(fèi)。而本研究建立的EHDV 抗體ELISA 檢測(cè)方法檢測(cè)成本低，適合國(guó)內(nèi)使用，將為我國(guó)EHD 防控節(jié)約大量經(jīng)濟(jì)成本，對(duì)EHD 防控具有重要意義。