下一代測序技術在食源性致病微生物風險識別和溯源中的應用

劉云哲，王 琳，張喜悅，鄒 明，王君瑋，趙 格

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心致病微生物監(jiān)測室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（青島），山東青島 266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東青島 266109）

近年來，食品中微生物含量超標導致的食源性致病微生物（主要指食源性致病菌）污染問題層出不窮。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）調(diào)研數(shù)據(jù)[1]顯示，全球每年因攝入被食源性致病菌污染的食物而罹患疾病的人數(shù)高達6 億，死亡人數(shù)約42 萬，死亡病例中5 歲以下兒童占比較高，達到了29.76%。在我國，每年約有1/6 的人因食用被食源性致病菌污染的食品而患病[2]。

美國疾病預防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）相關調(diào)查[3]表明，近幾年美國沙門氏菌感染率日漸增長，在食源性致病菌中居于首位。據(jù)我國相關報道[4]，沙門氏菌是引發(fā)微生物性食源性疾病的首位致病菌，而豬肉是首位歸因食品。實際上，可引發(fā)食源性疾病的常見致病菌還有大腸桿菌、單增李斯特菌等。此外還可能存在一些未知病原，這些病原往往難以通過常規(guī)檢測手段鑒定，因而導致相關部門不能對即將暴發(fā)的食品安全事件迅速作出反應。目前，諸如聚合酶鏈式反應（PCR）等分子生物學技術往往只能針對純化后的某一種細菌的特征性靶點開展檢測[5]，而下一代測序技術在快速檢測食源性致病菌和預防食源性疫情傳播，尤其是在發(fā)現(xiàn)未知食源性病原體方面擁有巨大潛力[6]。因此，為更好地對食源性致病菌進行監(jiān)測，采用更高效準確、靈敏特異的微生物檢測技術變得尤為重要。

1 技術簡介

下一代測序技術是一次性可對幾十萬到幾億的DNA 分子進行序列測定的高通量技術，正廣泛應用于生命科學各個領域。與傳統(tǒng)微生物檢測技術相比，下一代測序技術操作過程已經(jīng)實現(xiàn)了自動化或者半自動化，可以迅速精確地獲得樣品中的微生物基因組信息，且無需對樣品進行前增菌培養(yǎng)便可對其中的多種微生物同時進行分析。理想的下一代測序技術應該具有迅速、準確、花費低且易操作等優(yōu)點[7]。

目前，下一代測序技術主要指二代測序和三代測序技術。二代測序技術因其高通量、高效率、高準確性及低成本等優(yōu)勢逐漸普遍被應用于不同領域[8-13]。微生物的全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）技術在二代測序中應用較為廣泛，它能檢測樣品中各遺傳物質(zhì)的相關性，從而追溯疫病暴發(fā)源頭。2011 年，以PacBio等研發(fā)的SMRT 測序技術和Oxford 研發(fā)的Nanopore Technologies 為代表的三代測序技術應時而生[14-16]。三代測序技術面世后，微生物的宏基因組測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）有了更好的發(fā)展，特別是二代測序和三代測序技術聯(lián)合使用，實現(xiàn)了微生物宏基因組或者全基因組既高效又準確的測序。mNGS的優(yōu)勢在于能發(fā)現(xiàn)新病原體和以前未發(fā)現(xiàn)的病原體，而且能在未找到導致疾病暴發(fā)病原體的前提下對疫情進行初步診斷，這為及時檢測暴發(fā)疾病，開展溯源研究和風險評估，以及鑒定新的、難以發(fā)現(xiàn)的病原體提供了巨大幫助。

2 技術優(yōu)勢

目前對于食品微生物檢測，傳統(tǒng)檢測方法主要是先對致病菌分離培養(yǎng)，然后再依據(jù)國標GB 4789 系列的生化鑒定方法進行鑒定[17]。傳統(tǒng)鑒定微生物分子分型技術包括擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）[20]、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）[21]、脈沖場凝膠電泳（PFGE）[22]、多位點序列分型（MLST）[23]、多位點可變數(shù)串聯(lián)重復分析（MLVA）[24]等。這些常規(guī)技術常被用于食源性疾病暴發(fā)的病原基因型鑒定，很長一段時間里它們作為主要工具和金標準應用于食源性致病菌的監(jiān)測識別和溯源追蹤，但這些技術同樣普遍存在耗時長、檢測通量不高、準確性較低等弊端，而且操作過程繁瑣[25-26]。

近些年發(fā)展起來的mNGS 技術，同樣可應用于食源性致病菌檢測[18-19]。由于mNGS 技術可以針對采集的樣品一次性獲取所含有的微生物基因組和豐度信息，研究致病菌和樣本中其他菌類的相關性，特別是不會錯過傳統(tǒng)培養(yǎng)難以獲得的微生物信息，因此具有巨大潛力。

目前PFGE 等技術分辨率有限，特別是在區(qū)分屬于同一細菌克隆的菌株時；而WGS 技術則可以準確檢測難以培養(yǎng)的生物體，包括難以培養(yǎng)的細菌和厭氧菌[27]。此外WGS 技術可以取代目前基于PCR 的毒素檢測，如最近對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測證明[28]，WGS 抗菌表型和基因型表現(xiàn)出一致性，證明了WGS 可用于指導治療，并可用于發(fā)現(xiàn)新耐藥機制。

2012 年，在一次沙門氏菌疫情暴發(fā)中，PFGE無法將被污染的樣品與未被污染的同類食品區(qū)分開來；而WGS 技術不僅可以精確確定致病菌的物種亞型，而且可以檢測其對所有藥物的耐藥性[29]。Joensen 等[30-31]在應用WGS 技術的基礎上，建立了一個能夠及時準確識別產(chǎn)毒素大腸桿菌菌株的分型和監(jiān)測體系。Dallman 等[33]通過WGS 分析方法發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌病例之間的聚集性和關聯(lián)性，而且還發(fā)現(xiàn)了一些之前未發(fā)現(xiàn)的規(guī)模不大但分布較廣泛的聚集性疾病。對2007—2016 年加拿大散發(fā)的沙門氏菌病病例研究[33]發(fā)現(xiàn)，應用WGS方法檢測出來的數(shù)據(jù)與流行病學調(diào)查結果相一致，而常規(guī)PFGE 方法則無法對以上不同的暴發(fā)事件進行準確區(qū)分。

由上可見，下一代測序技術與傳統(tǒng)病原微生物檢測技術相比，具有快速準確、分辨率高等優(yōu)勢，在病原微生物鑒別診斷中發(fā)揮著越來越重要的作用。表1 列舉了二代和三代測序的特點[7]。

表1 主要的下一代測序技術比較

下一代測序技術以其明顯的優(yōu)勢成為近年來研究應用的熱點，但它也存在劣勢：低豐度的致病菌在樣本量不足時容易被其他序列信息掩蓋，同時該技術也不能獲得菌株進行下游試驗研究。所以，下一代測序數(shù)據(jù)在現(xiàn)階段更多的是作為補充，但隨著微生物組學的發(fā)展和配套生物信息方法學技術的進一步開發(fā)，它也將成為食源性致病菌基因組數(shù)據(jù)平臺中不可或缺的一部分[36]。

3 在食源性致病菌風險識別中的應用

3.1 生鮮動物產(chǎn)品

Edirmanasinghe 等[37]在對來自禽肉、屠宰場的家畜胴體和人類的腸炎沙門氏菌分離株進行WGS 分析和表型特征鑒定后，證明了腸炎沙門氏菌分離株在家畜、零售家禽和人類之間的傳播。Zagdoun 等[38]將Illumina MiSeq 測序方法應用于豬肉火腿的微生物細菌多樣性分析調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在其制作成火腿過程中（尤其是切片步驟）比生肉具有更高的微生物污染風險。

針對2014 年5—9 月在英國暴發(fā)的腸炎沙門氏菌病，研究人員對來自英國和歐洲其他國家病例的分離株進行了WGS 分析，證實英國的疫情與一家德國生產(chǎn)商的雞蛋有關[39]；2014 年6 月，研究人員使用下一代文庫制備和Illumina HiSeq 2500 測序技術檢測發(fā)現(xiàn)，法國6 起沙門氏菌病的暴發(fā)與1起奧地利沙門氏菌病有關，而法國和奧地利腸炎沙門氏菌病的暴發(fā)則與上述德國生產(chǎn)商供應的雞蛋有關[39]。WGS 以前曾被用于沙門氏菌的前瞻性監(jiān)測[40]以及多國沙門氏菌疫情暴發(fā)監(jiān)測，但在這里，它首次被用于實時鑒定多國沙門氏菌暴發(fā)，并及時告知相關部門應采用的公共衛(wèi)生控制措施[41]。

2015 年5 月—2018 年10 月，研究人員在歐盟和歐洲經(jīng)濟區(qū)調(diào)查了一起大型腸炎沙門氏菌疫情的多國暴發(fā)事件[42-44]，他們使用WGS 進行了一項病例對照研究，包括對從登記人口中隨機抽樣的確診/疑似病例以及2016 年10 月在食品機構進食的病例進行食品追溯對照研究，發(fā)現(xiàn)來自波蘭的雞蛋是感染媒介；通過系統(tǒng)發(fā)育分析，在人類病例中發(fā)現(xiàn)了兩株腸炎沙門氏菌，隨后在波蘭雞蛋的主要生產(chǎn)場所中發(fā)現(xiàn)了同樣的腸炎沙門氏菌株，從而證實疫情來源?？梢姡陔u蛋這種微生物污染較低的產(chǎn)品中，下一代測序技術在致病菌風險識別和監(jiān)測方面發(fā)揮了很大優(yōu)勢。

目前，我國尚無利用下一代測序技術進行食源性疾病暴發(fā)后病原溯源的相關報道，但已有研究采用WGS 技術分析畜產(chǎn)品中微生物組成。有學者[45]在我國西藏和俄羅斯采集自然發(fā)酵的牛奶，應用高通量技術檢測發(fā)現(xiàn)來自不同地域的牛奶樣品中微生物群落具有明顯差異。另有學者[46]運用基于16S rDNA 基因的高通量測序（HTS）技術對冷藏（4 ℃）豬肉的細菌微生物群落等進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)假單胞菌、不動桿菌和發(fā)光細菌在冷藏豬肉中占優(yōu)勢，并且這些分類群可加速冷藏豬肉腐敗。

3.2 生鮮植物產(chǎn)品

下一代測序技術同時也已應用于生鮮植物產(chǎn)品危害因子監(jiān)測。如沙門氏菌污染的番茄已多次造成食源性疾病暴發(fā)，Ottesen 等[47]利用MiSeq DNA 測序及mNGS 技術成功從番茄樣本中鑒別出沙門氏菌；Leonard[48]等從菠菜中識別到產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌；Andreevskaya 等[49]運用SOLiD 測序技術對豆類乳桿菌進行WGS 分析，發(fā)現(xiàn)其腐敗功能與丙酮酸代謝途徑異常有關，同時發(fā)現(xiàn)了該菌的特有基因。

2014 年9 月，美國CDC 收集了從全美病人、食品及環(huán)境中分離到的所有單增李斯特菌株，運用WGS 分析發(fā)現(xiàn)幾名患者的分離菌株與食用豆芽有關[50]，在運用了WGS 分析后的3 年內(nèi)，共監(jiān)測識別和解決了多達14 起的單增李斯特菌小規(guī)模暴發(fā)事件[50-51]。2014 年3 月，美國監(jiān)管機構發(fā)現(xiàn)被單增李斯特菌污染的生菜，僅使用PFGE 很難建立與同期患者分離株的聯(lián)系，然而應用WGS 分析表明來自俄亥俄州一名患者的分離株與生菜分離株高度相關[52]。

4 在食源性致病菌風險溯源中的應用

4.1 大腸桿菌

2011 年5 月，大腸桿菌O104:H4 型在德國暴發(fā)并且迅速蔓延。流行病學調(diào)查[53]顯示，埃及進口的豆芽是此次疫情暴發(fā)的源頭；傳統(tǒng)微生物學方法[54]顯示，此次暴發(fā)菌株的亞型和表型特征均相同；WGS 分析[55]發(fā)現(xiàn)，引起這起嚴重疫病暴發(fā)的菌株可能是通過水平轉(zhuǎn)移的方式，獲得了編碼志賀毒素的相關致病因子。2011 年在對德國暴發(fā)的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（O104:H4 型）腹瀉糞便樣品研究中，已經(jīng)證實WGS 可應用于食源性疾病暴發(fā)后病原體鑒別[56]。Underwood 等[57]選取一項早期大腸桿菌（O157:H7 型）暴發(fā)研究中患者及動物樣品，利用WGS 進行比較分析及致病菌鑒別，證明5 種亞型致病菌在感染人類前廣泛分布于該農(nóng)場區(qū)域，傳染源是動物和環(huán)境。

Saltykova 等[58]通過計算機模擬宏基因組學數(shù)據(jù)，將碎肉分離株與產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）暴發(fā)期間收集的人源分離株聯(lián)系起來，證明mNGS可用于食源性疾病暴發(fā)的溯源追蹤。Schaeffer[59]利用三代測序技術對大腸桿菌其他7 株分離自非洲的大腸桿菌以及4 株屬于其他血清型的大腸桿菌進行WGS 分析，數(shù)據(jù)顯示導致德國疾病暴發(fā)的大腸桿菌與其他大腸桿菌菌株不同，其屬于大腸桿菌另一個分支。

4.2 沙門氏菌

2009 年7 月，用于制作意大利臘腸的胡椒被沙門氏菌污染而引起食源性疾病暴發(fā)，Bakker等[60]選取暴發(fā)時的分離菌株和暴發(fā)前的菌株，經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)這些菌株具有完全相同的PFGE 圖譜，無法識別出暴發(fā)菌株；而通過wgSNP（基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性分型）分析，不僅能夠?qū)Ρ敬伪┌l(fā)的相關菌株進行準確識別，而且還監(jiān)測到之前一些未發(fā)現(xiàn)的引起小型暴發(fā)的菌株。這充分表明wgSNP 分子分型技術在暴發(fā)致病菌的風險識別和溯源分析上比傳統(tǒng)PFGE 技術具有更高的分辨力和準確度。

Ashton 等[61]應用二代測序技術中的Illumina HiSeq 平臺對2013 年暴發(fā)的沙門氏菌病進行了WGS 分析，證明了在蛋黃醬中分離到的鼠傷寒沙門氏菌是導致此次疾病暴發(fā)的病原菌。Hoffmann等[62]利用WGS 技術查明了造成金槍魚刮板被污染的400 多種腸炎沙門氏菌亞種的來源。

4.3 單增李斯特菌

Ruppitsch 等[63]對單增李斯特菌血清型代表菌株和暴發(fā)菌株進行wgMLST（全基因組多位點序列分型）分析方法應用比較，結果顯示wgMLST技術可以準確區(qū)分不同暴發(fā)的菌株以及與暴發(fā)相關或不相關的菌株。同時，wgMLST 技術可對MLST和PFGE 技術分型結果一致而流行病學卻并不相關的菌株加以區(qū)分。Gilmour 等[64]運用WGS 技術成功鑒別出2008 年加拿大食源性疾病暴發(fā)的致病菌為李斯特菌。

mNGS 在檢測受污染冰淇淋中的單增李斯特菌方面具有優(yōu)勢，并有研究[65]證明其可以將目前追溯所需時間減少一半?？梢?，下一代測序技術不僅可以發(fā)現(xiàn)菌株，還能精確了解病原菌的傳播源頭，明確傳播途徑等，甚至能夠精確區(qū)分疾病大流行中不同暴發(fā)事件的先后順序，同時還能發(fā)現(xiàn)其中隱藏的小疾病的聚集性暴發(fā)，這一點傳統(tǒng)分子分型方法難以做到，而這些特點在疾病追溯和預防控制中至關重要。

5 展望

目前二代測序技術占據(jù)主流市場，相信在不遠的未來三代測序技術會逐漸普及到各行各業(yè)。屆時，四代、五代等更先進的測序技術也將應運而生，甚至成為未來實驗室分析以及食品中食源性致病菌的常規(guī)檢測手段。二代和三代測序技術各有其優(yōu)勢及缺點，因此在實際檢測時應選擇合適方法，甚至2 種及以上方法結合使用。希望未來下一代測序技術能與更多新興方法相結合，使其不僅可應用于食源性致病菌的檢測識別及溯源，還能為更好地推動食品安全事業(yè)發(fā)展作出貢獻。