云南省部分養(yǎng)殖場雞傳染性貧血病毒核酸檢測及VP2 基因序列分析

王 斌，張振興，宋建領(lǐng)

（1.威信縣動物疫病預(yù)防控制中心，云南威信 657900；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224）

雞傳染性貧血（chicken infectious anemia，CIA）是由雞傳染性貧血病毒（chicken anemia virus，CAV）引起雛雞以貧血和免疫抑制為主要特征的傳染病，根據(jù)臨床癥狀又稱雞藍翅病、出血綜合征，早期也稱為雞貧血因子（chicken anemia agent，CAA），是危害我國家禽養(yǎng)殖的重要垂直傳播疫病之一。該病1979 年在日本被首次發(fā)現(xiàn)[1]，1992 年在我國被首次確認發(fā)生[2]，現(xiàn)今已在全球范圍內(nèi)蔓延[3-8]。2015 年7 月，該病病原被國際病毒分類協(xié)會歸分于圓環(huán)病毒科。CAV 核酸為環(huán)狀單股負鏈DNA，基因組大小為2 298 bp 或2 319 bp，編碼 VP1、VP2 和VP3 蛋白。其中，VP2 為非結(jié)構(gòu)蛋白，是CAV 最保守蛋白，因此在分子流行病學(xué)檢測中VP2基因作為PCR 檢測的首選基因。為了解近年來CAV 在云南省養(yǎng)雞場的流行及其VP2基因變異情況，2017—2020 年在昆明市、楚雄州、紅河州、玉溪市等家禽養(yǎng)殖密集區(qū)，采集樣品進行CAV 核酸檢測，并對部分陽性樣品進行VP2基因序列分析。

1 材料

1.1 病料

2017—2020 年，在昆明市、楚雄州、大理州、紅河州、玉溪市等家禽養(yǎng)殖密集區(qū)，采集89 個養(yǎng)雞場的疑似腫瘤疫病病雞肝臟樣品，冷藏送實驗室檢測。

1.2 主要試劑及儀器

DNA 核酸提取試劑盒、PCR 試劑盒和DL 2 000 DNA Marker 等，均購自大連寶生物公司；超凈工作臺（型號為LA2-4A1），購自ESCO 公司；PCR 儀（型號為9700），購自美國ABI（Applied Biosystems Inc）公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號為2000），購自美國BIO-RAD 公司。

2 方法

2.1 病料處理

將每份肝臟組織樣品剪碎，按1:5 的體積比加入滅菌PBS 研磨，將研磨后的混合物反復(fù)凍融3 次，3 000 r/min 離心10 min，取上清液提取核酸。

2.2 PCR 檢測

按照DNA 核酸提取試劑盒說明書，分別提取上清液的DNA 核酸。根據(jù)文獻[9]，合成CAV檢測引物（CAVF：5'-AATGAACGCTCTCCAAGAAG-3'；CAVR：5'-AGCGGATAGTCATAGTAGAT-3'），預(yù)期擴增產(chǎn)物582 bp。反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；95 ℃，45 s，52 ℃，50 s，72 ℃，45 s，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠，100 V 電泳30 min，觀察PCR 擴增結(jié)果。

2.3 VP2 基因擴增和序列分析

將PCR 檢測的代表性陽性樣品擴增后，按照膠回收試劑盒說明進行DNA 回收。回收的DNA送昆明碩擎生物測序。采用MegAlign 軟件，對VP2基因進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR 檢測

2017 年1 月—2020 年12 月，在昆明市、楚雄州、大理州、紅河州、玉溪市的89 個雞場共采集422 份樣品，檢出CAV 核酸陽性245 份，平均陽性率為58.06%。部分陽性樣品PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠結(jié)果見圖1。不同年份的核酸陽性率為53.61%～60.91%（表1），不同地區(qū)的核酸陽性率為51.68%～63.52%（表2），差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 不同年份病原核酸檢測結(jié)果

表2 不同地區(qū)病原核酸檢測結(jié)果

圖1 CAV 陽性樣品PCR 擴增結(jié)果

3.2 VP2 基因序列分析

自GenBank 數(shù)據(jù)庫下載國內(nèi)外已知的CAVVP2基因序列，采用MegAlign 軟件進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2）顯示：3 份CAV 陽性樣品VP2基因核苷酸序列同源性為99.6%～99.8%，與其他參考毒株1852TW和N7 之間的核苷酸同源性為99.6%～99.8%，均屬于Group A 分支，與Group C 分支的Australian 毒株同源性為98.2%～98.4%，與Group B 分支毒株的同源性為99.5%～99.6%。

圖2 CAV VP2 基因系統(tǒng)進化分析結(jié)果

4 討論

CAV 感染后，是否表現(xiàn)臨床癥狀與雞的年齡、毒株毒力以及伴發(fā)或繼發(fā)其他疫病等因素有關(guān)。該病主要表現(xiàn)為皮膚、喙、肉髯和可視黏膜蒼白以及發(fā)育遲緩、精神沉郁、消瘦等臨床癥狀，如果僅為單一感染，沒有并發(fā)和繼發(fā)其他疫病病原感染，則死亡率較低或表現(xiàn)一過性臨床特征。如果繼發(fā)其他病原感染，則可阻礙病雞康復(fù)，使病死率增高[10]。在血清流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該病的死亡率與飼養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)因素等密切相關(guān)，飼養(yǎng)環(huán)境好、飼料營養(yǎng)佳的雞場雖檢測到CAV 核酸陽性，但臨床癥狀不明顯，經(jīng)濟損失也小。李岳等[4]對我國部分地區(qū)進行血清流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，13 個省市疑似發(fā)病的381 個雞群中CAV 群陽性率為12.50%～50.00%，普遍存在于調(diào)查的 13 個省市中。另外有文獻[10]報道，黑龍江、廣西和安徽等省區(qū)的CAV 核酸陽性率為39.35%。本次檢測的云南省CAV 核酸陽性率為58.06%；李珂等[11]在云南省地方品種雞群4 種垂直傳播病毒血清流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)8 個地方品種雞群的CAV 抗體陽性率為98.47%。上述數(shù)據(jù)表明，云南省CAV 感染率較高，說明該病防控對于云南省家禽養(yǎng)殖業(yè)更為重要。CAV 與馬立克病毒（MDV）、禽白血病病毒（ALV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒（REV）等其他免疫抑制性病原雙重或三重混合感染率為52.94%[4]。本次檢測也發(fā)現(xiàn)了CAV 與 MDV、ALV 混合感染病例，表明 CAV 與其他免疫抑制性病毒混合感染現(xiàn)象普遍存在。另外，也有CAV 與新城疫病毒（NV）、禽流感病毒（AIV）混合感染的報道[9]。由于CAV在臨床癥狀和病理變化方面的表現(xiàn)沒有MDV、ALV、NDV、AIV 感染明顯，因此該病往往被養(yǎng)殖者忽視。

本次檢測發(fā)現(xiàn)，CAV 陽性樣品的VP2基因核苷酸序列同源性為99.6%～99.8%，與其他CAV 毒株VP2基因的核苷酸同源性也在98.2%以上，均屬于Group A 分支，與國內(nèi)流行毒株以Group A 群為主的報道[12-13]一致。因此，在該病毒核酸檢測中，VP2基因仍可作為PCR 檢測的首選目標基因。通過加強雞群CAV 監(jiān)測，淘汰陽性雞群和結(jié)合疫苗免疫，可減少該病造成的損失。