云南省某腹瀉仔豬群豬流行性腹瀉病毒核酸檢測及其N 基因序列分析

張振興，王 斌，宋建領

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224；2.威信縣動物疫病預防控制中心，云南威信 657900）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起仔豬和育肥豬的一種急性接觸性腸道傳染病，主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、脫水，多發(fā)生于哺乳仔豬，對哺乳仔豬具有高致死率[1]。PED 最早發(fā)生于1971 年的英國，1978 年比利時人Pensaert 等[2]首次分離鑒定出該病病原。2010 年后變異PEDV 毒株在中國、韓國、日本迅速蔓延，2013 年4 月擴散至美國，造成了嚴重經(jīng)濟損失，至今仍對全球養(yǎng)豬業(yè)危害巨大[3-4]。

PEDV 屬于套式病毒目（Ni-dovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）。其基因組核酸為單股正鏈RNA，基因組長度約為28 kb，編碼4 個結構蛋白（S、E、M 和N）和 4 個非結構蛋白（1a、1b、3a 和3b）[5]。N 蛋白是病毒粒子核衣殼的主要成分，通過結合RNA 將病毒基因組RNA 包裝到病毒顆粒的核衣殼中，在病毒復制和細胞感染過程中發(fā)揮重要作用[6]。

1 豬群腹瀉概況

2021 年2 月，云南省曲靖市某種豬場 47 頭母豬生產(chǎn)的564 頭仔豬出現(xiàn)嘔吐、黃色水樣腹瀉、脫水等臨床癥狀，其中10 日齡仔豬死亡367 頭，病死率為65.01%。死亡仔豬剖檢變化主要為皮下干燥，胃內(nèi)有黃白色凝乳塊，小腸嚴重擴張，腸壁內(nèi)充滿氣體，并伴有黃色液體，腸系膜充血，腸系膜淋巴結水腫。經(jīng)臨床初步診斷懷疑為PEDV 感染。

2 材料與方法

2.1 病料采集處理

采集3～5 頭病死仔豬腸道、腸系膜淋巴結、脾臟等組織病料，混合剪碎研磨，按照體積比1:10加入PBS，反復凍融3 次后，3 000 r/min 離心10 min，取上清液提取核酸。

2.2 核酸提取

按照RNA/DNA 核酸提取試劑盒說明書，提取組織上清液核酸。

2.3 引物合成

根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒（RVA）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）基因序列及相關文獻[7-10]，分別設計檢測引物，檢測引起仔豬腹瀉的常見病原核酸。引物序列信息見表1。

表1 病原核酸檢測引物序列

2.4 核酸檢測

以2.2 提取的核酸為模板，參照一步法RTPCR 試劑盒和PCR 試劑盒說明書，配制反應液。PEDV、TGEV、RVA、CSFV、PRRSV反應液：RNase Free dH2O 6.2 μL、2×1 Step Buffer 10.0 μL、Prime Script 1 step Enzyme Mix 0.8 μL、上游引物（20 μmol/L）0.5 μL、下游引物（20 μmol/L）0.5 μL、模板RNA 2.0 μL。PEDV 反應條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預變性2 min；95 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 10 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。TGEV、RVA、CSFV、PRRSV 反應條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PRV 反應液：RNase Free dH2O 7.0 μL、rTaqBuffer 10.0 μL、上游引物（20 μmol/L）0.5 μL、下游引物（20 μmol/L）0.5 μL、模 板DNA 2.0 μL；PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2.5 N 基因序列分析

將RT-PCR 檢測的PEDV 陽性樣品，用PEDV引物按如下反應體系擴增樣品N基因：RNase Free dH2O 16.0 μL、2×1 Step Buffer 25.0 μL、Prime Script 1 step Enzyme Mix 2.0 μL、上游引物（20 μmol/L）1.0 μL、下游引物（20 μmol/L）1.0 μL、模板RNA 5.0 μL。RT-PCR 反應條件同病原核酸檢測條件。擴增產(chǎn)物按TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 膠回收試劑盒說明書進行DNA 回收。回收的DNA 送昆明碩擎生物進行測序，采用MegAlign 軟件，對N基因進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。

3 結果與分析

3.1 病原核酸檢測

在采集的腸道、腸系膜淋巴結、脾臟等組織器官樣品中檢出PEDV 核酸陽性（圖1），而RVA、TGEV、PRRSV、CSFV、PRV 核酸檢測均為陰性（圖2～3）。

圖1 樣品PEDV PCR 擴增結果

圖2 樣品RVA、TGEV PCR 擴增結果

圖3 樣品PRRSV、CSFV、PRV PCR 擴增結果

3.2 N 基因序列分析

通過BLAST 比較后，自GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載國內(nèi)外公開的PEDVN基因序列和同源性高的PEDVN基因序列，采用Mega 6 軟件進行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析。序列比對結果顯示：PEDV 陽性樣品N基因與河北T10-HB2018 毒株核苷酸同源性最高，為99.7%，與經(jīng)典毒株CV777 同源性為95.7%，與疫苗株AJ1102 和LW/L 毒株同源性為97.4%～97.5%。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示：PEDV 陽性樣品N基因與疫苗毒株AJ1102 和LW/L 在同一個分支上，均屬于基因II 群（圖4～5）。上述結果表明，該豬場感染的PEDV 毒株N基因變異較小，與疫苗毒株同源性較高。

圖4 PEDV N 基因核苷酸同源性分析結果

圖5 PEDV N 基因系統(tǒng)進化分析結果

4 討論

PEDV 對豬腸道尤其是哺乳仔豬腸道具有極高的致病性，導致仔豬腸絨毛上皮細胞（以空腸和回腸為主）脫落，引起嚴重的腹瀉和嘔吐，繼而造成廣泛性脫水，使感染仔豬大批量死亡。本病例臨床癥狀和剖檢變化都出現(xiàn)了典型的PED 特征，通過RT-PCR 檢測和N基因序列分析，確診該場發(fā)病原因為PEDV 感染。針對病因采取疫苗緊急免疫和對癥治療，獲得了比較理想的治療效果，免疫后豬群再次出生的仔豬，發(fā)病率降低5%左右。仔豬腹瀉仍是現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)主要疫病癥候群之一，導致仔豬死亡率高，阻礙其生長發(fā)育，降低飼料利用率，給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟損失。但是仔豬腹瀉病因復雜，除了常見的細菌病、病毒病、寄生蟲病等傳染因素外，還與豬場的管理、水質(zhì)、飼料等因素密切相關。為了更有效地控制仔豬腹瀉，減少仔豬腹瀉引起的損失，必須通過實驗室檢測，確定引起仔豬腹瀉的主要因素，繼而采取針對性防控措施，只有這樣才能獲得比較好的治療效果[11-12]。

PEDV 的N 蛋白在病毒感染豬腸壁后的自我復制過程中發(fā)揮重要作用，由其編碼的病毒核衣殼蛋白具有很好的抗原性[13]，在PEDV 感染早期就能在血液中產(chǎn)生N 蛋白特異性抗體和誘導細胞免疫[14]，因此N基因可以作為PEDV 早期感染檢測的目標基因。該豬場感染毒株N基因與疫苗毒株同源性較近，這與翟新國等[15]對河北省一株PEDV S1 基因的遺傳變異與重組分析結果一致，說明當前疫苗對防控該毒株有效，因而采取PEDV疫苗緊急免疫，獲得了比較理想的防控效果。而陳果亮等[16]發(fā)現(xiàn)湖南省一株PEDV 的N基因?qū)儆诨騃 群，說明我國PEDV 毒株存在多樣性。此次在云南省檢出的PEDV 陽性樣品N基因雖然與經(jīng)典毒株、疫苗毒株同源性都較高，但其也有基因多樣性特點，因此應加強PEDV 的分子流行病學監(jiān)測，及時了解其變異特性，從而為PEDV 疫苗的改進和更新提供依據(jù)。