2017—2021 年廣西腹瀉豬群主要病毒性腹瀉病原檢測

段群棚，秦毅斌，何文娜，趙 武，盧冰霞，周英寧，全琛宇，趙 碩，馮建遠(yuǎn)，梁家幸，蔣冬福，李 斌，陳婷婷，許心婷，盧敬專，陳忠偉，何 穎

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；2.廣西大學(xué)，廣西南寧 530005；3.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)金光有限公司，廣西南寧 530022）

豬病毒性腹瀉是由病毒引起的急性消化道傳染病，主要病原為豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和 豬 丁型冠狀病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）4種。豬群感染上述病毒后臨床表現(xiàn)極為相似，均表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和脫水。豬病毒性腹瀉發(fā)病急，傳播速度快，各年齡段豬均易感，但仔豬病死率更高，感染情況更嚴(yán)重；耐過存活豬群生長發(fā)育遲緩，飼料轉(zhuǎn)化率、日增重等明顯降低，會增加養(yǎng)殖成本，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約生豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

PEDV 于1971 年在英國育肥豬群和架子豬群中被首次發(fā)現(xiàn)。1978 年在比利時(shí)分離到類似冠狀病毒的病原CV777，通過致病性試驗(yàn)證實(shí)該分離病毒是引起豬病毒性腹瀉的病原[1-2]，隨后該病原在世界各地廣泛流行[3]。2010 年以來，隨著新型PEDV 變異毒株的出現(xiàn)，我國大部分省份大規(guī)模暴發(fā)了嚴(yán)重的豬病毒性腹瀉疫情[4-7]，哺乳仔豬病死率可高達(dá)100%。至今該變異毒株仍對我國乃至世界范圍內(nèi)生豬養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成巨大威脅。Woode 和Bridge 于1974 年在英國首次分離出PoRV[8]。隨后多個(gè)國家及地區(qū)相繼檢測到該病毒，我國于1981年在腹瀉仔豬糞便中首次分離到該病毒。TGEV 于1933 年在美國被首次發(fā)現(xiàn)，1946 年首次由美國學(xué)者分離并鑒定。我國于1956 年首次報(bào)道在廣東發(fā)現(xiàn)該病，隨后在全國各地區(qū)都有該病發(fā)生和流行的有關(guān)報(bào)道[9-11]。PDCoV 于2012 年首次在我國香港地區(qū)被發(fā)現(xiàn)。2014 年2 月美國在豬腹瀉糞便中首次檢測到PDCoV，隨后韓國和我國內(nèi)陸地區(qū)多個(gè)省份也從豬腹瀉樣品中檢測到該病原[5-7，12-15]。

近年來，廣西地區(qū)無論是大型規(guī)?；B(yǎng)豬場還是生豬個(gè)體養(yǎng)殖戶均出現(xiàn)了嚴(yán)重的病毒性腹瀉疫病，給廣西養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，為摸清引起廣西地區(qū)豬群腹瀉的主要病毒性病原及其危害程度，了解本地區(qū)豬病毒性腹瀉疫病的流行態(tài)勢，2017 年1 月至2021 年6 月應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法，對廣西14 個(gè)地級市489 個(gè)豬場送檢的1 206 份臨床腹瀉樣品開展上述4 種病毒性病原檢測，并分析不同年份、季節(jié)、地區(qū)、年齡段豬群之間的差異以及病原混合感染情況，以揭示廣西地區(qū)豬群病毒性腹瀉疫病的流行狀況、特點(diǎn)及規(guī)律，為進(jìn)一步制定合理的綜合防治措施提供技術(shù)依據(jù)，也為養(yǎng)殖場豬病毒性腹瀉綜合防控提供流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本次調(diào)查的臨床腹瀉樣品均為被動送檢樣品。2017 年1 月—2021 年6 月，廣西14 個(gè)地級市489個(gè)豬場先后自主送檢臨床上有腹瀉癥狀豬只的腸內(nèi)容物和糞便樣品1 206 份。自主送檢豬場均為種豬場，豬場規(guī)模大小不一，母豬存欄量為50～8 000 頭。不同豬場送檢的樣品數(shù)量不一，豬場根據(jù)豬只發(fā)病情況隨機(jī)采集臨床腹瀉樣品，送檢的樣品數(shù)量跟豬場當(dāng)時(shí)發(fā)病情況相關(guān)，與豬場規(guī)模大小無明確相關(guān)性。

表1 2017—2021 年豬群腹瀉樣品送檢情況統(tǒng)計(jì)

1.2 主要儀器與試劑

Q5 熒光定量PCR 儀，賽默飛；病毒基因組DNA/RNA 快速抽提試劑盒，Axygen 生物科技有限公司產(chǎn)品；PEDV、PoRV、TGEV 三重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測試劑盒，哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；PDCoV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測試劑盒，IDEXX 公司產(chǎn)品。

1.3 病料處理及病毒RNA 提取

取腹瀉病豬的腸內(nèi)容物和糞便樣品，按體積比1:5 加入生理鹽水，在組織研磨器內(nèi)進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融3 次，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清200 μL，按照Axygen 病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒說明書提取核酸，作為模板用于檢測。

1.4 PEDV、PoRV 和TGEV 檢測

嚴(yán)格按照相應(yīng)的試劑盒說明書檢測PEDV、PoRV 和TGEV。結(jié)果判定：陽性對照Ct ≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對照無Ct 值并且無特異性擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品若FAM熒光信號Ct ≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線為PEDV陽性；被檢樣品若HEV 熒光信號Ct ≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線為TGEV 陽性；被檢樣品若CY5熒光信號Ct ≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線為PoRV陽性。被檢樣品30 ＜Ct ＜37 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，需重新取樣提取RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽性；被檢樣品Ct ≥37 時(shí)，超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現(xiàn)S 型曲線，但本底較高的樣品，判定為陰性。

1.5 PDCoV 檢測

嚴(yán)格按照相應(yīng)的試劑盒說明書檢測PDCoV。結(jié)果判定：陽性對照FAM 熒光信號Ct ＜38 且HEX（VIC）熒光信號Ct ＜38，并同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對照FAM 熒光信號Ct 值無信號和HEX（VIC）熒光信號Ct 值無信號并且均無特異性擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立。若被檢樣品FAM熒光信號Ct 值有信號并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判定為陽性；若被檢樣品FAM 熒光信號Ct 值沒有信號并且無特異性擴(kuò)增曲線，HEX（VIC）熒光信號有Ct 值，并同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判定為陰性；若被檢樣品FAM 熒光信號Ct 值無信號和HEX（VIC）熒光信號Ct 值無信號并且均無特異性擴(kuò)增曲線，判定為無效。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

2017 年1 月至2021 年6 月，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測方法，對采自廣西的1 206 份臨床腹瀉樣品分別進(jìn)行PEDV、PoRV、TGEV、PDCoV等4 種病毒性腹瀉病原檢測，并分析其陽性檢出率在不同年份、季節(jié)、地區(qū)、年齡段豬群之間的差異以及病原混合感染情況。季節(jié)劃分：3—5 月為春季，6—8 月為夏季，9—11 月為秋季，12 月至次年2月為冬季。同一份樣品只檢測到1 種病原陽性為單一感染，同時(shí)檢測到2 種病原陽性為二重感染，同時(shí)檢測到3 種病原陽性為三重感染，依次類推。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0，對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)），統(tǒng)計(jì)分析其差異性，年份間采用χ2趨勢檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同病原檢出情況

檢測結(jié)果（表2）顯示：2017—2021 年，廣西送檢的臨床腹瀉樣品中PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV 等4 種病原均有檢出，樣品陽性檢出率分別為49.67%、4.56%、0.33%和7.63%，場平均陽性檢出率分別為53.37%、8.18%、0.61%和8.18%。PEDV 在廣西豬場送檢的腹瀉樣品中樣品陽性率和場陽性率均最高（P＜0.05），說明PEDV 已成為導(dǎo)致廣西豬群腹瀉的最主要病毒性腹瀉病原。

2.2 不同年份檢出情況

由表2 可知：2017—2021 年，PEDV 陽性檢出率整體呈波浪狀下降趨勢，2018 年樣品陽性檢出率和場陽性檢出率均最高，2020 年最低，差異顯著（P＜0.05），2021 年陽性檢出率相比2020年略有升高，但差異不顯著（P＞0.05），各相鄰年份間差異不顯著（P＞0.05）；PoRV 陽性檢出率呈逐年升高趨勢，各相鄰年份間差異顯著（P＜0.01），2021 年樣品和場陽性檢出率均顯著高于2017和2018年（P＜0.05），也高于2019和2020年，但差異不顯著（P＞0.05），說明其流行加重趨勢開始減緩；TGEV 總體陽性檢出率較低，2017—2019 年未有檢出，2020 年后有少量樣品檢出陽性；PDCoV 陽性檢出率呈波浪狀變化，2017、2019、2021 年陽性檢出率較高，2018、2020 年檢出率較低，但各相鄰年份間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 2017—2021 年廣西臨床腹瀉樣品4 種腹瀉病原檢測結(jié)果

2.3 不同季節(jié)檢出情況

由表3 可知：PEDV 冬季樣品和場陽性檢出率均最高，其中樣品陽性檢出率與其他季節(jié)差異明顯（P＜0.05），場陽性檢出率顯著高于夏季（P＜0.05），但與春、秋季差異不顯著（P＞0.05）；PoRV 春季樣品和場陽性檢出率均最高，與夏、秋季差異不顯著（P＞0.05），但冬季陽性檢出率最低，與其他季節(jié)差異顯著（P＜0.05）；TGEV 陽性檢出率秋季略高，但一年四季間差異不顯著（P＞0.05）；PDCoV 春、冬季樣品陽性檢出率顯著高于夏、秋季（P＜0.05），但各季節(jié)的場陽性檢出率差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同季節(jié)臨床腹瀉樣品4 種腹瀉病原檢測結(jié)果

2.4 不同地區(qū)檢出情況

由 表4 可 知：PEDV 在 廣 西14 個(gè) 地 市均有不同程度感染，樣品陽性檢出率介于14.29%～75.86%，其中貴港、崇左、玉林檢出率較高，超過60%，而河池最低，不足15%；PoRV 在賀州、桂林、南寧等9 個(gè)地級市有檢出，陽性檢出率較低；TGEV 僅在南寧、桂林、防城港的樣品中零星檢出，陽性檢出率極低；PDCoV 除防城港外，在其他13個(gè)地市均有檢出，說明PDCoV 作為一種新發(fā)疫病開始在廣西普遍流行，其中河池、北海、百色樣品陽性檢出率已超過20%。

表4 廣西各地臨床腹瀉樣品4 種腹瀉病原檢測結(jié)果

2.5 不同年齡段豬群檢出情況

由表5 可知：PEDV 在不同年齡段豬群中均有陽性檢出，說明PEDV 對各年齡段豬群均易感，但哺乳仔豬和后備母豬陽性檢出率較高，顯著高于公豬、母豬、保育豬和育肥豬（P＜0.05）；PoRV 在后備母豬和保育豬中的陽性檢出率偏高，但不同年齡段豬群間無顯著差異（P＞0.05）；TGEV 只在母豬、哺乳仔豬中有零星陽性檢出，不同年齡段豬只陽性率差異不顯著（P＞0.05）；PDCoV 在母豬中的陽性檢出率最高，顯著高于哺乳仔豬和保育豬（P＜0.05），但與公豬、后備母豬、育肥豬差異不顯著（P＞0.05）。

表5 不同年齡段豬群臨床腹瀉樣品檢測結(jié)果

2.6 病原混合感染情況

由表6 可知：腹瀉樣品以單一感染為主，總單一感染率為58.38%，其中PEDV 單一感染率最高（47.93%），其次是PDCoV（6.72%）和PoRV（3.48%），TGEV 最低（0.25%）；存在較低比例的二重感染，未發(fā)現(xiàn)三重及以上感染，其中二重感染主要表現(xiàn)為PEDV 與其他病原的混合感染，不同混合感染類型間感染率差異不顯著（P＞0.05）。

表6 廣西臨床腹瀉樣品病原混合感染情況

3 討論

近年來，由腹瀉造成的豬群死亡率不斷升高，其中病毒的危害最為嚴(yán)重，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，尤其是PEDV、PoRV、TGEV 和PDCoV。為了解導(dǎo)致廣西豬群腹瀉的主要病原及感染程度，2017 年1 月—2021 年6 月共收集了廣西14 個(gè)地市489 個(gè)豬場1 206 份臨床腹瀉樣品，進(jìn)行上述4 種病原的核酸檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹瀉豬群中PEDV 感染最嚴(yán)重，樣品陽性檢出率為49.67%。徐麗華等[5]2011—2017 年對浙江省不同地區(qū)豬臨床腹瀉樣品進(jìn)行了PEDV、PoRV、TGEV 和PDCoV 檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV 陽性檢出率最高，為71.25%；朱子健等[16]2015—2016 年對東北三省規(guī)模豬場的264 份臨床腹瀉樣品進(jìn)行了PEDV、PoRV 和TGEV 的檢測，也發(fā)現(xiàn)PEDV 陽性檢出率最高，為74.62%；路超等[17]對2016—2018 年天津市規(guī)?；i場腹瀉樣品進(jìn)行PEDV、PDCoV、TGEV、PoRV 檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV 陽性檢出率最高，為51.28%；常新見等[7]2017—2019 年對華東地區(qū)35 個(gè)場594 份臨床腹瀉樣品進(jìn)行PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV 檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV 陽性檢出率最高，為62.6%。以上數(shù)據(jù)表明，廣西和全國大部分省份檢測結(jié)果一致，PEDV 是引起豬病毒性腹瀉的最主要病原。另外，廣西也存在PDCoV、PoRV 和TGEV 感染，雖然總體發(fā)病率不高，但感染呈上升趨勢，同樣不容忽視。

從時(shí)間分布上發(fā)現(xiàn)，PEDV 感染整體呈下降趨勢，這可能與2019 年國內(nèi)發(fā)生非洲豬瘟疫情后生豬存欄量下降及豬場普遍加強(qiáng)生物安全管理密切相關(guān)。2021 年P(guān)EDV 感染有輕微抬頭趨勢，這可能與非洲豬瘟疫情得到控制后，生豬生產(chǎn)迅速恢復(fù)，存欄量逐漸升高有關(guān)。2017—2021 年，PoRV 陽性檢出率逐年上升，說明PoRV 感染日趨嚴(yán)重，可能原因是近年來廣西豬場普遍放松了對PoRV 的免疫預(yù)防，以及PoRV 出現(xiàn)了多種基因型[18]，導(dǎo)致市售疫苗達(dá)不到完全保護(hù)相關(guān)。TGEV 雖然在2017—2019 年腹瀉豬群中未檢出，但2020—2021 年有零星檢出，仍需持續(xù)關(guān)注。PDCoV 感染在2021 年出現(xiàn)上升趨勢，應(yīng)加強(qiáng)綜合防控，避免PDCoV 出現(xiàn)大規(guī)模流行。

豬腹瀉的發(fā)生有明顯的季節(jié)性，這與主要病原的流行特征有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，冬季PEDV 感染率顯著高于其他季節(jié)，而冬季PoRV 感染率卻較低，這與董波等[19]研究發(fā)現(xiàn)閩西地區(qū)冬季PoRV 感染率最高有較大差異，相關(guān)原因有待進(jìn)一步探究；TGEV 的季節(jié)性特征尚不明顯，但其并非導(dǎo)致廣西豬群腹瀉的主要病原；PDCoV 冬、春季感染率明顯高于夏、秋季，這與路超等[17]研究發(fā)現(xiàn)天津市PDCoV 感染高峰期在春季和秋季不太一致，與施開創(chuàng)等[20]、嚴(yán)瑾等[21]研究發(fā)現(xiàn)的廣西PDCoV 在第二、三季度多發(fā)，存在一定差異。上述研究數(shù)據(jù)表明，豬病毒性腹瀉一年四季均可發(fā)生，腹瀉疫苗的免疫須列入常規(guī)免疫程序，進(jìn)行常年免疫。

從空間分布上看，PEDV 在廣西14 個(gè)地市均有分布且感染率較高，其中在貴港、崇左和玉林等生豬主產(chǎn)區(qū)尤為嚴(yán)重，樣品陽性檢出率均超過60%；PDCoV 除未在防城港檢出外，其他13 個(gè)地級市均有不同程度感染。上述檢測結(jié)果說明，PEDV 和PDCoV 在廣西已普遍存在。PoRV 在賀州、桂林、南寧等9 個(gè)地市有檢出，說明PoRV 在廣西呈局部性流行。TGEV 只在南寧、桂林、防城港有零星檢出，說明TGEV 呈零星散發(fā)，并非導(dǎo)致豬群腹瀉的主要病原。以上結(jié)果說明，廣西地區(qū)應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)PEDV、PDCoV 和PoRV 感染的防控，建立健全生物安全防控體系，切斷病毒傳播途徑，減少病毒擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡段豬只中，哺乳仔豬PEDV 感染率顯著高于公豬、母豬、保育豬、育肥豬，但與后備母豬差異不顯著。哺乳仔豬腹瀉跟后備母豬密切相關(guān)。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，絕大部分豬場都是從頭胎母豬生產(chǎn)的哺乳仔豬開始發(fā)生腹瀉，然后迅速擴(kuò)散傳播。哺乳仔豬腹瀉發(fā)病率高可能跟后備母豬抗體水平普遍偏低、自身免疫系統(tǒng)不完善、抗病力弱等因素相關(guān)。保育豬、育肥豬感染率也較高，這是因?yàn)槠渌劳雎势?，腹瀉疫苗價(jià)格較高，大部分豬場不對其進(jìn)行免疫。與哺乳仔豬PEDV感染率顯著高于母豬不同，哺乳仔豬PoRV 感染率與母豬差異不顯著，哺乳仔豬TGEV 與PDCoV 感染率均顯著低于母豬，至于其原因，有待進(jìn)一步探究。上述研究數(shù)據(jù)表明，雖然不同年齡段豬群中的PEDV、PoRV、TGEV 和PDCoV 感染程度有所不同，但各年齡豬群對其均易感，腹瀉程度可能與豬抵抗力差異有關(guān)，成年豬多呈隱性感染，哺乳仔豬病死率最高，危害最為嚴(yán)重。

本研究對4 種病毒單獨(dú)感染和混合感染進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)廣西腹瀉豬群的病毒性感染以單一感染為主，主要是PEDV 單一感染，感染率為47.93%；混合感染均為二重感染，二重感染率為1.91%，主要表現(xiàn)為PEDV 與其他病原的混合感染，未發(fā)現(xiàn)有三重及以上感染，說明廣西腹瀉豬群的病毒混合感染狀況尚不嚴(yán)重，但需要加強(qiáng)防控。

4 結(jié)論

廣西腹瀉豬群主要病毒性腹瀉病原檢測發(fā)現(xiàn)：近年來PEDV 已成為導(dǎo)致廣西豬群腹瀉的最主要病毒性病原，PoRV 在廣西呈局部流行且日趨嚴(yán)重，新出現(xiàn)的PDCoV 有呈地方性流行趨勢，TGEV 仍為零星散發(fā)。上述病原主要表現(xiàn)為單一感染，但已出現(xiàn)二重混合感染。4 種病毒性腹瀉病原在廣西不同地區(qū)、不同年齡段豬群和不同季節(jié)的流行特征并不明顯，需要建立完善的豬場生物安全防控體系和科學(xué)的常規(guī)免疫程序來進(jìn)行綜合防控。