非小細胞肺癌EGFR罕見突變及其靶向與免疫治療策略

馮惠儀，吳明瑋

1 背景

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的激活突變發(fā)生在10%～20%的白種人和至少50%的亞洲非小細胞肺癌（NSCLC）患者中［1-3］。外顯子19的缺失和外顯子21的單個氨基酸取代L858R，通常稱為“經(jīng)典”EGFR突變，共同構(gòu)成了NSCLC中EGFR突變的約85%，對EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFRi）治療敏感［4］。罕見突變占NSCLC中EGFR突變約15%，包括EGFR基因第18～25外顯子內(nèi)的點突變，缺失和插入突變［5］。每年全世界有30 000多名NSCLC患者新診斷攜帶罕見的EGFR突變。因此，了解罕見的EGFR突變的腫瘤特征并提供相應的臨床治療方案的選擇具有重要的臨床意義。但是，很少有臨床試驗能夠系統(tǒng)地評估EGFRi在具有罕見EGFR突變的NSCLC患者中的療效。由于臨床數(shù)據(jù)的匱乏，該領(lǐng)域很大程度上依賴于臨床試驗和隊列研究的事后匯總分析，以評估這一類患者中的EGFRi反應。例如，基于對LUX-Lung 2、LUX-Lung 3和LUX-Lung 6這三個臨床試驗的匯總分析的證據(jù)，F(xiàn)DA在2018年批準了第二代EGFRi阿法替尼用于治療S768I、L861Q和G719X罕見EGFR點突變［6］。本文我們將詳細闡述具有此類罕見的EGFR突變的患者的EGFRi反應的臨床前和臨床證據(jù)，為該類患者的臨床治療方案的選擇提供參考。

圖1 EGFR突變類型

2 EGFR18號外顯子突變

最常見的EGFR突變發(fā)生在第19外顯子中，而第18外顯子突變較為罕見，占所有EGFR突變的4.1%［5］。18外顯子突變包括以下幾種情況。

2.1 E709X和外顯子18缺失

E709的突變包括缺失delE709-T710insD（也稱為外顯子18缺失）和E709替代A、G、K或V的情況，其中E709K最常見。這些突變約占NSCLC中罕見EGFR突變的1.5%。在delE709-T710insD突變的基礎上，超過75%在同一腫瘤中檢測到其他EGFR突變，例如L858R，Ex19Del或G719X，E709氨基酸取代被，這些都稱為“復合突變”［7，8］。

2.1.1 臨床前研究為了研究E709X突變，目前針對罕見突變最完整的臨床前研究是Kobayashi等人的研究。針對E709X突變，他們在Ba/F3和NIH-3T3細 胞 中 表 達E709K和delE709-T710insD［5］。E709X突變的Ba/F3細胞在缺乏IL-3的情況下生長，以及E709X突變的NIH-3T3細胞的成瘤能力增加，表明這些突變是致癌的驅(qū)動因素。為了了解這些突變的EGFRi敏感性，筆者使用7種不同的EGFRi對Ba/F3細胞進行了劑量反應實驗。第一代抑制劑吉非替尼和厄洛替尼，第二代抑制劑阿法替尼、達科替尼和來那替尼，以及第三代抑制劑奧西替尼和羅西替尼。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與表達Ex19Del的Ba/F3細胞相比，E709K和delE709-T710insD對吉非替尼，厄洛替尼和奧西替尼的敏感性均顯著降低，其中delE709-T710insD顯示出對這些抑制劑的最大抗性。E709K和delE709-T710insD對第二代抑制劑阿法替尼和來那替尼的敏感性與Ex19Del相當。對表達E709K，delE709-T710insD和Ex19Del的HEK293細胞進行的蛋白質(zhì)印跡分析表明，在用阿法替尼和來那替尼處理后，EGFR的活性在每種細胞系中均受到抑制。使用相同劑量的吉非替尼，厄洛替尼或奧西替尼治療，抑制作用較小，表明與第一代或第三代抑制劑相比，第二代EGFRi對罕見突變E709X和外顯子18缺失突變型EGFR具有最大的親和力，提示臨床治療可能有效。

2.1.2 臨床研究由于E709X替代和外顯子18缺失突變的發(fā)生率較低，因此對這些患者的臨床反應知之甚少。Kobayashi等［5］報道了15例E709X復合突變患者的53%反應率（response rate，RR），4例用第一代EGFRi治療的delE709_T710insD患者的25%RR。該數(shù)據(jù)提示E709突變對第一代EGFRi總體更敏感。但在另一項研究中［6］，報道了一例52歲的女性，患有delE709_T710insD突變的雙側(cè)晚期肺腺癌，對阿法替尼治療有明顯的臨床反應（time to treatment failure，TTF大于12個月）。以上研究病例數(shù)較少，且結(jié)果不一致，因此第二代EGFRi對于E709X突變是否更有效仍需進一步的臨床數(shù)據(jù)支持。

2.2 G719X

G719X在NSCLC中罕見的EGFR突變中，G719X取代（包括G719S，G719A，G719C和G719D取代）是僅次于外顯子20插入的較常見突變之一，約占NSCLC中所有EGFR突變的1.5%～3%［9］。G719X突變可以作為獨立的EGFR突變發(fā)生，也可以與其他點突變（例如S768I或L819Q）組合存在。

2.2.1 臨床前研究小林等［7］的研究表明，在體外表達G719A突變的Ba/F3細胞對第二代EGFRi的敏感性高于第一代EGFRi。他們發(fā)現(xiàn)，與表達Ex19Del的細胞相比，G719A對吉非替尼，厄洛替尼和奧西替尼的反應較差，而對第二代EGFRi阿法替尼和那拉替尼敏感，IC90分別為0.9 nM和1.1 nM。蛋白質(zhì)印跡分析表明，使用高達1 μM的第一代或第三代EGFRi對G719A細胞進行處理，與使用10 nM阿法替尼處理的效果相當（即阿法替尼的IC50更低），使G719A突變細胞幾乎完全喪失了EGFR活性。提示阿法替尼可能對G719A突變的肺癌有效，而第一代或第三代EGFRi可能療效不佳。

2.2.2 臨床研究Chiu等［8］人在針對罕見的EGFR突變的最大的臨床研究中評估了吉非替尼和厄洛替尼在78個單一G719X突變患者與普通Ex19Del和L858R突變患者之間的療效。盡管具有單個G719X突變的患者對第一代EGFRi治療敏感（總緩解率（ORR）=36.8%，疾病控制率（DCR=72.4%，n=78），但與L858R突變相比（ORR=67.5%，DCR 50=95.6%，n=256）或Ex19Del（ORR 8=65.3%，DCR 9=94.5%，n=222）療效較差。G719X患者的中位PFS為6.3個月，而L858R和Ex19Del患者的中位PFS為10～13個月。與臨床前研究一致，在G719X患者中，第二代EGFRi已被證明比第一代抑制劑更有效。對來自LUX-Lung 2，LUX-Lung 3和LUX-Lung 6試驗的32位患者的數(shù)據(jù)進行事后分析顯示，阿法替尼抗罕見的EGFR突變型（G719X，S786I，L861Q）有臨床療效。在8個具有單個G719X突變的患者和6個具有復雜G719X突變的患者中，阿法替尼治療有77.8%的RR和13.8個月的PFS，這在2018年1月使FDA擴大了阿法替尼的適應癥，以包括具有G719X的NSCLC患者突變。最近的一項Ⅱ期臨床試驗表明，19名具有G179X突變的患者第三代抑制劑奧西替尼的RR為52.6%［9］。但是，與阿法替尼治療相比，奧西替尼是否可以提供顯著的生存獲益，尚需進一步試驗。

3 外顯子20插入

EGFR外顯子20插入突變涵蓋1～7個氨基酸的異質(zhì)插入范圍，該插入范圍發(fā)生在αC螺旋的C末端。在經(jīng)典突變之后，EGFR外顯子20插入是NSCLC中次常見的EGFR突變，據(jù)報道其發(fā)生率在所有觀察到的EGFR突變中占4%～10%［10，11］。既往研究提示該類型突變可能會導致患者對TKI耐藥。

3.1 臨床前研究

EGFR外顯子20插入突變體的晶體結(jié)構(gòu)表明，外顯子20插入形成了一個楔形物，會導致P環(huán)和αC螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而導致相對較小的藥物結(jié)合口袋，從而在空間上阻礙第一代EGFRi的結(jié)合［12］或可“推動”αC螺旋并阻止其向外旋轉(zhuǎn)為非活性構(gòu)象，從而導致激酶結(jié)構(gòu)域的組成性激活。因此，不同的EGFR外顯子20插入突變顯示出對EGFRi的不同敏感性。Yasuda等［15］發(fā)現(xiàn)A763_764insFQEA與第一代EGFRi吉非替尼具有高度親和力，而D770_N771insNPG沒有。臨床前研究使用Ba/F3和NIH-3T3模型系統(tǒng)評估了5個外顯子20插入突變對第二代EGFRi的敏感性，并指出達克替尼對于在770位包含甘氨酸殘基的插入特別有效［15］。劑量反應實驗也表明，只有表達D770delinsGY突變的細胞對達克替尼（17.5 nM）敏感。根據(jù)標準劑量每天1 mg給藥后達克替尼的血漿濃度預測患者的藥物敏感性仍在Ⅱ期試驗中［16］。

另外一項研究表明，在使用CRISPR技術(shù)改造成可表達D770_N771insSVD或V769_D770InsASV插入的肺癌細胞系H2073細胞的異種移植模型中，奧西替尼具有顯著的抗腫瘤活性［17］。

此外，在一項波齊替尼靶向外顯子20插入突變能力的研究中，顯示波齊替尼具有靈活的喹唑啉核心和小的連接基團，基于3D建模，已預測其緊密結(jié)合外顯子20插入EGFR激酶的受限藥物結(jié)合口袋［14］。Robichaux等［13］在Ba/F3細胞中表達了7種不同的EGFR外顯子20插入突變，劑量反應實驗表明，表達EGFR外顯子20插入突變的細胞對低劑量的波齊替尼敏感。接受波齊替尼治療后，突變型EGFR活性明顯降低了，提示波齊替尼對外顯子20插入的突變患者可能有效。

3.2 臨床研究

攜帶EGFR外顯子20插入片段的大多數(shù)NSCLC患者對第一代和第二代EGFRi均具有抗藥性，報道的低應答率在0%～27%之間［18，19］。多個研究表明，對于攜帶A763_Y764insFQEA插入的患者，對厄洛替尼有部分反應，與傳統(tǒng)的EGFR突變相比，其對第一代EGFRi的敏感性相似［20］。盡管目前獲得許可的EGFRi并未顯示對其他EGFR外顯子20插入的患者有任何顯著益處，但新興的EGFRi（包括波齊替尼等）正在臨床研究中，對于該亞組NSCLC患者可能有效［21］。

4 S768I

除插入第20外顯子外，點突變S768I發(fā)生在EGFR基因第20外顯子中編碼αC螺旋的區(qū)域，據(jù)報道其頻率為EGFR突變的0.6%～1%［5，22］。

4.1 臨床前研究

Banno等［14］研究發(fā)現(xiàn)，與L858R突變相比，表達EGFR S768I的Ba/F3細胞對第一代和第三代EGFRi的敏感性較低。蛋白質(zhì)印跡分析表明，表達S768I的Ba/F3s在用100 nM厄洛替尼或奧西替尼處理后仍然保留了EGFR活性，但用10 nM阿法替尼處理足以減少S768I EGFR的活性。Bann等［14］人研究了S768I的食道癌細胞系KYSE540，進一步證明S768I與L858R相比對第一代和第三代EGFRi有抗性，但對第二代EGFRi阿法替尼敏感。

4.2 臨床研究

盡管S768I突變可以單獨發(fā)生，但更常見的是S768I與EGFR中的其他點突變共同出現(xiàn)，形成復合突變。在對S768I突變患者的多個案例研究中，報告了對第一代EGFRi的反應差異很大［15］。Leventakos等［15］報道了4例孤立的S768I突變或S768I/G719X或S768I/L858R復合突變的患者在PFS從3到30個月不等。有趣的是，Chiu等［16］觀察到，與單獨的單個S768I點突變相比，復雜突變S768I/G719X對第一代EGFRi處理可能更敏感，復合S768I突變的RR為50%（n=10），而單個S768I突變33%RR（n=7）。在LUX-Lung 2，LUX-Lung 3和LUX-Lung 6試驗的事后分析中，第二代EGFRi阿法替尼對8例S768I突變型NSCLC患者實現(xiàn)了100%ORR和14.7個月中位PFS，F(xiàn)DA因此批準該藥物用于EGFR S768I突變的NSCLC患者。但是7/8的S768I突變患者中攜帶有G719X或L858R突變的復雜突變，僅1例患者具有單獨S861I突變。因此，尚不清楚阿法替尼是否將對單S768I點突變的患者表現(xiàn)出一致的反應，因此，較大的隊列研究正在進行。

5 L861Q

L861Q位于EGFR的激活環(huán)內(nèi)，約占NSCLC中EGFR突變的3%［17］。

5.1 臨床前研究

在Ba/F3模型系統(tǒng)中對L861Q的研究表明，與S768I突變相似，與L858R相比，L861Q對第一代EGFRi有抗性，但與S768I不同，L861Q對阿法替尼和奧西替尼均敏感［15］。蛋白質(zhì)印跡分析顯示在用厄洛替尼處理后，表達L861Q的細胞中EGFR活性得以保留，而在用10 nM阿法替尼或100 nM奧西替尼處理后，EGFR活性消失了。帶有內(nèi)源性EGFR L861Q突變的食道癌細胞系KYSE270也顯示出與Ba/F3模型對阿法替尼或奧西替尼有類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明第二代和第三代抑制劑都可能有效靶向L861Q突變。

5.2 臨床研究

Chiu等［18］報道了57個L861Q突變患者的最大隊列研究，觀察到第一代EGFRi的RR為40%，即與L858R相比，L861Q突變對第一代EGFRi的敏感性降低。LUX-LUNG試驗顯示，阿法替尼治療導致12例單L861Q點突變的患者，3例L861Q/G719X的患者和1例L861Q/Ex19Del復雜的突變的患者，RR為56%和8.2個月中位數(shù)。這些數(shù)據(jù)支持L861Q突變對阿法替尼敏感，因此FDA批準阿法替尼用于L861Q突變陽性NSCLC。奧西替尼的Ⅱ期臨床試驗報告了77.8%的L861Q突變患者（n=9）有部分反應［9］。這些數(shù)據(jù)支持臨床前觀察，即L861Q突變對第三代EGFRi敏感，并表明奧西替尼可能是具有L861Q突變的患者的有效治療選擇。

6 EGFR激酶結(jié)構(gòu)域重復（EGFR-KDD）

EGFR-KDD最常見的是外顯子18～25或外顯子18～26的重復，它編碼酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，盡管已經(jīng)報道了外顯子14～26和17～25重復的情況［19］。EGFR-KDD于2015年在NSCLC中首次被描述。兩項多中心研究報告稱EGFR-KDD的發(fā)生率分別為EGFR-KDD的0.2%（n=1010）［20］和0.24%（n=5394）［19］。突變的NSCLC患者，表明重復可能是肺癌中最罕見的EGFR突變類型之一。

6.1 臨床前研究

與野生型EGFR相比，小鼠成纖維細胞系和Ba/F3細胞EGFR-KDD表現(xiàn)出高水平磷酸化。Gallant等還發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)源性EGFR-KDD的人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系A1235細胞在存在和不存在血清的情況下均表現(xiàn)出高水平的EGFR活性。為了研究EGFR-KDD對目前可用的EGFRi的敏感性，他們用厄洛替尼，阿法替尼和奧西替尼分別處理的表達EGFR-KDD的Ba/F3細胞，他們發(fā)現(xiàn)EGFR-KDD對阿法替尼最敏感。提示阿法替尼對于EGFR-KDD突變患者有潛在的臨床療效［21］。

6.2 臨床研究

在Baik等人的病例報告中，攜帶EGFR-KDD的肺癌患者表現(xiàn)出對吉非替尼二線治療持續(xù)6年的持久治療反應。在化療和培美曲塞治療失敗后后，用厄洛替尼作為四線治療可以額外延長約3年的生存獲益［22］。在另一例病例報告中，Gallant及其同事報道了一名患有NSCLC的EGFR-KDD患者，經(jīng)過2個療程的阿法替尼治療后顯示出部分反應［21］。

7 復合突變

在NSCLC中EGFR突變的情況下，術(shù)語“復雜”或“復合”可以指3種可能的情況：①經(jīng)典L858R或Ex19Del EGFR突變，其中也包含其他EGFR突變（經(jīng)典+罕見）；②在同一等位基因上同時發(fā)生的多個獨特的罕見EGFR突變（罕見+罕見）；或③L858R和Ex19Del EGFR突變（經(jīng)典+經(jīng)典）的組合。據(jù)報道，復合突變占NSCLC中EGFR突變的約5%～15%［23，24］。

7.1 臨床前研究

Kohsaka等［25］人在一組NSCLC標本上進行EGFR外顯子測序，發(fā)現(xiàn)超過90%的G719X突變（n=15）以復合突變形式存在。COSMIC數(shù)據(jù)庫（n=102）中超過75%的E709X突變也以復雜突變的形式存在。Kohsaka等在NIH-3T3和Ba/F3細胞 系 模型中，在順式表達復雜突變的NIH-3T3細胞比單一突變或反式復合突變形成更多的病灶。表明復合突變的轉(zhuǎn)化潛力要比單獨的罕見EGFR突變的轉(zhuǎn)化潛力更高。使用高通量篩選評估單個突變和復合突變的EGFR突變對吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和奧西替尼的反應的研究中，發(fā)現(xiàn)每個復雜EGFR突變的IC50值介于每個對應的單個EGFR突變之間。例如，吉非替尼單獨治療L858R（4.4 nM）的IC50值低于L858R+E709A（259 nM），但是與單一E709A罕見突變（785.8 nM）相比，復雜突變對藥物治療更敏感。有趣的是，不可逆的第二代EGFRi阿法替尼并未觀察到這些差異，阿法替你在所有測試的單個和復雜EGFR突變中均相似的抑制作用。

表1

7.2 臨床研究

復合突變的患者對EGFRi的反應差異性很大。罕見的EGFR突變與經(jīng)典L858R或Ex19Del突變（罕見-經(jīng)典組合）對EGFRi治療敏感［26，27］。Baek等［27］報道，EGFRi治療復合的經(jīng)典和罕見突變組合（經(jīng)典-罕見組合）的中位PFS為7.4個月，復合的罕見和罕見突變組合（罕見-罕見組合）的中位PFS為5.1個月次之，而單個的罕見突變的PFS最短中位PFS分別為1.3個月和2.6個月。這支持了臨床前數(shù)據(jù)，復雜突變比單個罕見突變對EGFRi更敏感［25］。

8 罕見突變的免疫治療

越來越多的證據(jù)支持在NSCLC中使用免疫療法進行治療，與約20%的晚期NSCLC患者（包括帕博利珠單抗，納武利尤單抗）化療相比，靶向PD1/PD-L1免疫檢查點抑制劑已顯示出明顯的PFS和OS獲益。與具有經(jīng)典EGFR突變的NSCLC患者中相比，罕見的EGFR突變與更長的中位PFS相關(guān)［28］。

對接受帕博利珠單抗或納武利尤單抗治療的EGFR突變NSCLC患者的回顧性分析顯示，與具有經(jīng)典突變的患者相比，具有G719X和外顯子20插入突變的患者具有更長的中位PFS（8.4個月vs.1.6個月）。但這項研究樣本量較小（n=27），需要進行更大樣本量的未來臨床研究以驗證罕見EGFR突變的免疫療法的有效性。此外，免疫療法是否優(yōu)于現(xiàn)有的EGFRi（如阿法替尼）尚不明確。山田等［29］報道了用帕博利珠單抗或納武利尤單抗治療外顯子20插入突變的患者的中位PFS為8.4個月，而接受阿法替尼治療的外顯子20插入的中位PFS 2.7個月。這些數(shù)據(jù)表明免疫療法可能是外顯子20插入突變的首選治療選擇。

另外一項研究［30］描述了4例具有罕見EGFR突變和高PD-L1表達（＞50%）的NSCLC患者。該研究中3名帶有G719X突變，用帕博利珠單治療有效。其余1例患者具有E746_T751delinsA+T790M復合突變，盡管PD-L1表達達60%，但對帕博利珠單抗治療無反應。另一項Ⅰ期臨床研究中，Getting等人［31］報告稱13名EGFR突變患者中有2例患者在使用納武利尤單抗5年隨訪中仍存活，這兩個患者均攜帶罕見的突變（分別為G719A和外顯子20插入突變）且PD-L1表達低（＜1%）。攜帶G719A的患者在治療方案完成后16個月出現(xiàn)部分疾病進展。繼續(xù)使用納武利尤單抗又獲得了再8個月的PFS。攜帶第20外顯子插入突變的患者在接受納武利尤單抗治療后獲得9個月的PFS?？偟膩碚f，這些研究表明免疫療法可能對某些罕見的EGFR突變有效。

另一種潛在的策略是將EGFRi與免疫療法相結(jié)合來獲得更好的臨床療效。EGFRi和體外免疫療法的結(jié)合已表明，短期厄洛替尼治療可以通過上調(diào)caspase介導的凋亡來增強具有經(jīng)典EGFR突變的NSCLC細胞系對細胞毒性殺傷細胞和T細胞殺傷的敏感性［32］，即序貫或聯(lián)合的EGFRi和免疫療法可能會延遲對靶向療法的耐藥性產(chǎn)生，增加反應性。正在進行一些臨床試驗，評估在未接受EGFRi治療或?qū)GFRi耐藥的NSCLC中EGFRi和免疫療法的結(jié)合［33］。盡管這些試驗的數(shù)據(jù)尚不成熟，但與單獨的EGFRi相比，免疫療法和EGFRi聯(lián)合療法可能使患者耐藥時間延長［34］。因此，需要進一步的研究工作來闡明患者中EGFRi和免疫療法之間是否存在協(xié)同作用，哪些患者最有可能受益，以及最佳藥物調(diào)度策略將是什么。

9 總結(jié)

與經(jīng)典EGFR突變相比，許多罕見的EGFR突變與對第一代EGFRi的反應較差，但是臨床研究已經(jīng)提示，二代或三代TKI，如阿法替尼等可能具有更好的臨床療效。免疫療法在具有罕見EGFR突變的患者中初步顯示出療效效，可能為EGFRi罕見突變或反應性差的患者打開了新的治療策略。研發(fā)更有效的預測免疫治療療效的標記物，以及免疫治療聯(lián)合化療或靶向治療的有效性，可能是未來的主要研究方向之一。