MrgD通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)肝癌細胞脂肪酸代謝

區(qū)婷婷，曾楠，杜弢

細胞內(nèi)的脂肪代謝對于維持細胞正常的能量代謝和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著不可忽視的作用，腫瘤細胞異常增殖所需能量供應(yīng)除了增加葡萄糖攝入消耗供能外，也可通過增加脂肪代謝供能［1］。有研究發(fā)現(xiàn)減少脂肪積累或者減弱脂質(zhì)代謝可影響前列腺細胞的癌變進程［2］，另有研究指出脂肪代謝與腫瘤細胞耐藥和化療不敏感度有關(guān)［3，4］，這些研究提示靶向脂肪酸合成可能成為腫瘤治療的新策略［5］。

最近的一項研究發(fā)現(xiàn)抑制脂肪酸和膽固醇的合成可以有效降低肝癌的發(fā)生［6］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在肝細胞脂肪變性和肝癌進展中發(fā)揮重要作用，許多疾病如高脂血癥、炎癥、病毒等可干擾肝細胞ER的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，進而導(dǎo)致肝脂質(zhì)代謝失調(diào)與肝細胞的炎性壞死、凋亡，促進肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）中ACE2/Ang-（1-7）/Mas軸對維持機體肝臟脂代謝的穩(wěn)態(tài)非常重要［8，9］。其中Mas受體可緩解ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的HepG2細胞的ERS，從而減少HepG2細胞內(nèi)甘油三酯的積累［10］。Mas受體相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體D（MAS-related G-protein Coupled Receptor member D，MrgD），又稱為MrgprD或TGR7，與Mas受體具有一定比例的同源性。這兩個受體對機體的血管與心臟等發(fā)揮類似的保護作用，如舒張血管［11，12］、抗心肌纖維化、抗心室肥大［13，14］等。目前，關(guān)于MrgD對肝癌細胞脂肪代謝方面的作用尚不清楚，本研究將初步探討MrgD調(diào)控肝癌細胞脂肪代謝和ERS的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

HepG2及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株在含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 構(gòu)建過表達與干擾MrgD的穩(wěn)定HepG2細胞株

將pcDNA3-MRGD-EGFP表達質(zhì)粒質(zhì)粒（Addgene）的人源MrgD全長序列克隆插入CMV-eGFPPGK-Puro表達載體質(zhì)粒中的eGFP，獲得MrgD表達載體PGMLV-CMV-H_MRGD-eGFP-PGK-Puro。同時，設(shè)計針對人源MrgD序列干擾的MrgD-shRNA質(zhì)粒，插入PGMLV-SC5載體，構(gòu)建MrgD干擾載體H_MRGD-shRNA1（PGMLV-SC5）。上述質(zhì)粒載體均帶有嘌呤霉素篩選抗性。用構(gòu)建的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，收集病毒原液，超濾濃縮并測定病毒滴度。用包裝好的慢病毒以及慢病毒陰性對照感染HepG2細胞并用嘌呤霉素篩選，得到目的轉(zhuǎn)染穩(wěn)定細胞株，qRT-PCR評估MrgD表達變化。

表1 MrgD shRNA oligo序列

1.3 HepG2細胞脂肪變性模型的構(gòu)建與驗證

1.3.1 在1%BSA低糖DMEM培養(yǎng)基中，以油酸和棕櫚酸按一定比例配置200 μM游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA），用于誘導(dǎo)細胞脂肪變性模型。

1.3.2 選用生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的HepG2細胞，胰酶消化、離心、重懸后，計數(shù)按5.0×104/孔的密度鋪于24孔板（6孔板則按1.5×105/孔種板），隔夜培養(yǎng)細胞穩(wěn)定貼壁后，細胞密度約70%，對照組每孔加入500 μL（6孔板按2 mL/孔）含1% BSA的低糖DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加入等體積的200 μM FFA高脂培養(yǎng)基（由1% BSA的培養(yǎng)基稀釋），繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.3.3 油紅O染色觀察細胞脂質(zhì)沉積：油紅O粉末（Sigma），以異丙醇溶解配置0.5%油紅O母液，與ddH2O按3∶2比例混勻后過濾配置工作液，按試劑標準步驟對4%多聚甲醛固定后的細胞進行染色觀察。

1.4 Western Blot法檢測相關(guān)蛋白表達

提取細胞蛋白進行蛋白濃度的測定及調(diào)配后，以10%SDS-PAGE凝膠進行電泳后轉(zhuǎn)膜。用一抗稀釋液按1∶1000分別稀釋相如下的抗體：并下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（Sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）（CST）、乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase，ACC1）（CST）、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip）（CST）、GAPDH（Santa），置4℃緩慢搖床中孵育過夜，用含5%脫脂牛奶的1×TBST按照1∶5000的比例稀釋二抗；ECL法顯影，用Image J軟件各目的條帶的灰度值進行分析。

1.5 qRT-PCR檢測相關(guān)mRNA表達

Trizol法提取細胞總RNA，參照TaKaRa RR036A逆轉(zhuǎn)錄試盒說明書，將細胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR參照TaKaRa RR820A（TB Green Premix Ex TaqⅡ）說明書，使用Roche LightCycler?480Ⅱ進行qRT-PCR程序。通過內(nèi)參基因的Ct值計算出目的基因的相對表達量。以Folds=2-ΔΔCt公式比較目的基因的表達差異，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）處理組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組。qRT-PCR引物序列：H_MRGPRD-F：GCTGTTCGTGGTGGTCCTG；H_MRGPRD-R：GGAGAGGCGTGACAAGCTG；H_GAPDH-F：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG；H_GAPDH-R：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA。

1.6 細胞免疫熒光

對數(shù)生長期的細胞消化重懸后計數(shù)，按8×104/孔于24孔板中均勻種板，細胞貼壁后當(dāng)細胞達到約40%匯合度進行免疫熒光觀察。MrgD一抗和二抗Cy3均按1∶500比例稀釋；按標準步驟進行抗體孵育后，在熒光顯微鏡下，選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源，觀察、采集圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 2.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤（±s），采用GraphPad Prism 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、作圖，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2的MrgD過表達與干擾穩(wěn)定株的構(gòu)建與鑒定

對構(gòu)建的人源MrgD表達載體PGMLV-CMVH_MRGD-eGFP-PGK-Puro和含有MrgD序列干擾的MrgD-shRNA質(zhì)粒測序鑒定正確后，構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞，得到穩(wěn)定表達細胞株，通過qRT-PCR與Western Blot分別檢測細胞株MrgD的mRNA與蛋白水平。qRT-PCR（圖1A）結(jié)果顯示過表達細胞MrgD的mRNA水平較對照細胞顯著上升（P＜0.001），4組shRNA干擾組細胞MrgD的mRNA水平較其對照組明顯降低（P＜0.001），其中shRNA3最低，后續(xù)試驗均選用感染shRNA3序列細胞株；免疫熒光顯示的MrgD蛋白表達有同樣的趨勢（圖1B）。

圖1 過表達和低表達MrgD的HepG2穩(wěn)定株的建立與鑒定A：qRT-PCR檢測細胞MrgD mRNA表達水平，以GAPDH為內(nèi)參；B：免疫熒光觀察細胞MrgD蛋白表達。Lv-Con：過表達對照組；Lv-MrgD：MrgD過表達組；Sh-Con：干擾對照組；Sh-MrgD：MrgD干擾組；*P＜0.001。

2.2 體外脂肪變性模型的構(gòu)建

采用含200 μM的由棕櫚酸（palmitic acid，PA）和油酸（oleic acid，OA）混合的FFA脂性培養(yǎng)基刺激HepG2細胞12 h。設(shè)置4個分組：對照組（1%BSA處理）以及OA∶PA比例分別為1∶2、1∶1、2∶1的FFA處理組，之后用MTS測定各組細胞的活性。結(jié)果顯示200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）處理細胞12 h不影響細胞活性（圖2A），故選用該方案誘導(dǎo)細胞脂肪變性并進行油紅O染色。結(jié)果顯示，與1%BSA培養(yǎng)基處理的對照組對比，F(xiàn)FA處理的HepG2細胞內(nèi)的橘紅色脂滴顯著增加（圖2B）。

圖2 FFA誘導(dǎo)HepG2細胞脂滴堆積分別用含1%BSA（模型對照組）與含200 μM FFA的低糖DMEM培養(yǎng)基（模型組）培養(yǎng)HepG2細胞12 h A：MTS檢測200 μM的FFA（OA∶PA=1∶2、1∶1、2∶1）的處理HepG2細胞12 h的活性。*P＜0.05，**P＜0.01。B：200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）誘導(dǎo)細胞12 h的油紅O染色。

2.3 MrgD改善FFA誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

為探究MrgD是否對肝臟脂肪代謝有影響，通過油紅O染色觀察MrgD過表達對FFA誘導(dǎo)后細胞內(nèi)脂滴沉積含量的影響，Western blot檢測脂肪合成相關(guān)蛋白（ACC1）以及ERS標記蛋白（BiP、ATF4）水平。結(jié)果顯示，在HepG2脂肪變性模型中，MrgD過表達明顯抑制了FFA誘導(dǎo)的顯著增加的脂滴蓄積（圖3A）；FFA誘導(dǎo)后，對照組細胞脂肪合成標記蛋白SREBP2、ACC1和ERS標記蛋白BiP水平上調(diào)，而過表達MrgD下調(diào)了上述蛋白的表達（圖3B）。

圖3 MrgD對肝細胞脂肪變性的影響用200 μM的FFA誘導(dǎo)MrgD過表達組及其對照12 h，進行后續(xù)實驗的驗證A：油紅O染色觀察各組脂滴沉積情況；B：Western Blot檢測過表達組的脂肪合成相關(guān)蛋白（ACC1、SREBP2）與ERS標記蛋白（BiP）水平。

2.4 干擾MrgD促進FFA誘導(dǎo)的肝細胞脂肪變性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

同時，MrgD干擾HepG2細胞脂肪變性后，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，MrgD干擾后FFA誘導(dǎo)的脂滴合成顯著增加（圖5A）；相應(yīng)的脂肪合成標記蛋白SREBP2、ACC1表達水平顯著上調(diào)，同時ERS標記蛋白BiP表達水平增高（圖5B）。

3 討論

脂質(zhì)代謝失調(diào)和炎癥是癌細胞的常見表型［15］，細胞內(nèi)脂肪酸作為膜脂、信號分子和修飾基團的生物合成前體為腫瘤生長提供能量儲存［16］。脂質(zhì)合成、攝取和儲存通常在肝癌發(fā)生中上調(diào)，靶向脂質(zhì)代謝可能是一種有前途的癌癥治療方法［17］。本研究發(fā)現(xiàn)在肝臟腫瘤細胞株HepG2中上調(diào)MrgD表達可通過抑制脂肪合成、改善ERS途徑顯著改善肝癌細胞脂肪變性，研究提示MrgD相關(guān)通路可能成為研究肝癌防治策略的新方向。

圖4 干擾MrgD對肝細胞脂肪變性的影響A：經(jīng)FFA誘導(dǎo)后各組的油紅O染色；B：Western Blot檢測FFA誘導(dǎo)后各組的脂肪合成相關(guān)蛋白（ACC1、SREBP2）與ERS標記蛋白（BiP）。

FFA常用于誘導(dǎo)建立脂肪變性細胞模型［18，19］，油酸（OA）和棕櫚酸（PA）是體內(nèi)常見的FFA，可合成甘油三酯并儲存于肝細胞胞質(zhì)中。體內(nèi)甘油三酯含量過高會導(dǎo)致肝細胞脂肪變性，F(xiàn)FA能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的3條信號通路［20］。ERS的激活可導(dǎo)致肝脂質(zhì)代謝失調(diào)與肝細胞的炎性壞死、凋亡，在肝細胞脂肪變性和肝癌進展中發(fā)揮重要作用［7］。本研究應(yīng)用200 μM的FFA（OA∶PA=2∶1）誘導(dǎo)HepG2細胞脂肪變性，造模后肝細胞ERS及脂肪合成相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平顯著升高。

RAS對維持機體肝臟脂代謝的穩(wěn)態(tài)非常重要，Mas受體是其中關(guān)鍵的一員，Mas受體敲除小鼠表現(xiàn)出肝臟脂質(zhì)蓄積增強和脂肪合成相關(guān)蛋白上調(diào)，而過表達Mas受體則會扭轉(zhuǎn)上述變化趨勢［21］。MrgD受體是與Mas受體有一定比例同源性，與Mas受體發(fā)揮許多相似的生理作用，但其MrgD在肝細胞脂代謝中的作用尚不清楚。本研究通過構(gòu)建FFA誘導(dǎo)的MrgD受體過表達與干擾的HepG2細胞脂肪變性模型，發(fā)現(xiàn)高表達MrgD明顯降低FFA誘導(dǎo)的胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)含量，并下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（SREBP2）和乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）。SREBP2是參與脂質(zhì)合成的調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。已有研究表明［22，23］，SREBP2表達受AdipoR1/AMPK/SIRT1信號通路調(diào)控的，AMPK激活后也可直接作用于SREBP2，使其磷酸化，進而下調(diào)SREBP2的靶基因，如參與膽固醇和脂肪酸生物合成等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。ACC1同樣在脂肪酸合成中起主要作用。ACC是一類生物素羧化酶，其催化乙酰輔酶A和碳酸酯的ATP依賴性縮合以形成丙二酰輔酶A，后者是從頭脂肪生成的必需和限速底物，也是肝臟組織細胞中長鏈脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶CPT-1（Carnitine palmitoyltransferase 1，肉毒堿-棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1）的變構(gòu)抑制劑［24］。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)高表達MrgD可抑制免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（Bip），同時在低表達MrgD細胞中觀察到相反的結(jié)果。BiP是一種高度保守的分子伴侶，它充當(dāng)Ca2+的調(diào)節(jié)劑協(xié)助蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并通過其兩個結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合域和底物結(jié)合域協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊過程。BiP作為維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑，可激活涉及未折疊蛋白反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄，也是ERS的主要標記物［25］。已有的研究表明，F(xiàn)FA作用肝細胞后，脂肪合成基因SREBP-1c和BiP的mRNA和蛋白水平以及脂肪酸合成酶mRNA顯著增加，參與肝細胞脂肪變性過程［26］。這些研究結(jié)果提示MrgD可能通過調(diào)控ERS參與調(diào)節(jié)肝癌細胞脂肪合成。

綜上，本研究在體外初步揭示了MrgD通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制肝癌細胞脂肪合成。調(diào)節(jié)肝細胞的脂質(zhì)代謝異常及緩解ERS的機制，從而阻止或延緩肝臟脂肪變性和肝癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為肝癌防治的一個有效方法，本研究有助于深入研究MrgD通路在肝癌細胞脂肪變性中的作用和機制，探討其在肝癌防治中的潛在價值。